Фенотипические и функциональные свойства мезенхимальных стромальных клеток человека в норме и при иммунопатологических заболеваниях 14. 03. 09 Клиническая иммунология, аллергология



страница1/4
Дата29.06.2015
Размер0,49 Mb.
  1   2   3   4
На правах рукописи

Шевела Екатерина Яковлевна

Фенотипические и функциональные свойства мезенхимальных стромальных клеток человека в норме и при иммунопатологических заболеваниях
14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Новосибирск – 2012



Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Черных Елена Рэмовна

Официальные оппоненты:

Гайдуль Константин Валентинович доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, экспериментальный отдел, ведущий научный сотрудник лаборатории регуляции иммунопоэза
Поспелова Татьяна Ивановна доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой терапии, гематологии и трансфузиологии, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Алексеев Леонид Петрович член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, засл. деятель науки РФ, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, заместитель директора по научной работе и инновационной деятельности

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Томск)

Защита состоится «____» ______________ 2013 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН
Автореферат разослан «____» _______________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Белогородцев Сергей Николаевич

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) относятся к классу соматических стволовых клеток, характеризуются фибробластоподобной морфологией, адгезивностью, быстрым ростом в культуре in vitro и способностью к самоподдержанию и дифференцировке в клетки тканей мезодермального происхождения [da Silva Meirelles L., 2006, Сaplan А. et al, 1994], а в определенных условиях - в клетки тканей экто- и эндодермального происхождения [Сaplan A., 1994, Pittenger 1999]. Учитывая низкую иммуногенность МСК и способность к направленной миграции [Bhakta S., 2006, Croitoru-Lamoury J., 2007, Li Y., 2007], в последние годы эти клетки стали предметом интенсивных исследований в качестве потенциальных клеточных кандидатов для стимуляции репарации различных тканей. Действительно, многочисленные экспериментальные исследования продемонстрировали клинический эффект МСК в моделях различных заболеваний и повреждений органов и тканей [Cai L., 2009, Wei X., 2009, Caplan A., 2011, Viswanathan S., 2011]. Однако быстрое развитие клинического эффекта и очень низкое количество интегрированных в зоне повреждения МСК склонило к предположению, что клинический эффект МСК обусловлен не столько трансдифференцировкой/клеточным замещением, сколько паракринными эффектами этих клеток.

Действительно, исследование биологических свойств МСК продемонстрировало, что стимуляция репаративных процессов может опосредоваться способностью МСК оказывать антиапоптотический эффект и трофическую поддержку различным типам клеток, а также стимулировать неоваскуляризацию и активировать пролиферацию и дифференцировку тканеспецифических стволовых клеток [Caplan A., 2006, Ruiz С., 2007, van Poll D., 2008, Kim J., 2009, Цыб А.Ф., 2009].

Кроме того, выяснилось, что важным биологическим свойством МСК является их иммунорегуляторная активность, обусловленная способностью МСК к продукции широкого спектра иммуноактивных цитокинов и ростовых факторов [Caplan A., 2006]. Наиболее исследованной является иммуносупрессорная активность МСК, которая in vitro характеризуется четким дозозависимым эффектом, проявляется в отношении практически всех видов иммунных клеток (Т- и B-лимфоцитов, НК-клеток, антиген-презентирующих клеток) и опосредуется с вовлечением множества механизмов, включая продукцию иммуносупрессивных цитокинов, простагландина Е2, оксида азота, экспрессию IDO и др. [Corcione A., 2006, Kim J., 2009, Nauta A.J., 2006, Beyth S., 2005, Aggarwal S., 2005]. Иммуносупрессивный эффект высоких доз МСК продемонстирован также in vivo и обсуждается в качестве обоснования применения МСК в лечении аутоиммунных заболеваний и трансплантационных реакций [Bocelli-Tyndall C., 2007, Ben-Ami E., 2011]. Вместе с тем, в определенных условиях МСК могут обладать иммуностимулирующим потенциалом, на что указывает экспрессия на поверхности МСК антигенов MHC I класса, наличие внутриклеточного пула молекул MHC II класса, экспрессия различных молекул адгезии и TLRs, а также способность МСК фагоцитировать апоптотические клетки [Wan Tso G.H., 2010]. В отличие от супрессорной, иммуностимулирующая активность МСК исследована в значительной меньшей степени, и вопрос о значении этой функции остается до сих пор открытым.

Еще одним проявлением регуляторной функции является гемопоэзстимулирующая активность МСК, обусловленная участием этих клеток в создании гемопоэтического микроокружения и продукции факторов, стимулирующих пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [Le Blanc K., 2007, Ball L., 2007, Kim J., 2009]. Поэтому в настоящее время активно обсуждается целесообразность использования МСК с целью ускорения восстановления кроветворения при трансплантации стволовых кроветворных клеток пациентам гемобластозами после высокодозной химиотерапии [Le Blanc07, Ball L., 2007, Isaikina Y., 2008]. Однако наличие супрессорной активности МСК вызывает определенные опасения в плане возможного неблагоприятного влияния МСК на иммунную реконституцию и эффективность иммунной защиты в посттрансплантационном периоде.

Многочисленными исследованиями показано, что источником МСК может быть не только костный мозг, но и жировая ткань, плацента, пуповинная кровь, эндометрий, пульпа молочных зубов и другие ткани [Zuk P., 2001, Gronthos S., 2001, Rodriguez A. 2005, Alsalameh S., 2004, Erices A., 2000, Bieback K., 2004, de Mos M., 2007, Roufosse C., 2004, Fukuchi Y., 2004]. Полученные из различных тканей МСК в целом отвечают Минимальным критериям, разработанным для стандартизации этих клеток. Тем не менее, имеются отдельные факты о фенотипических и функциональных особенностях МСК различного тканевого происхождения [Bochev I., 2008, Najar M., 2010, Anzalone R., 2010, Mitchell J., 2006], что диктует необходимость сравнительной характеристики свойств выделенных из разных тканей МСК для успешного развития клеточной технологий.

Важно отметить, что использование аутологичного клеточного материала считается наиболее безопасным. Однако применение МСК у больных с различными патологиями ставит вопрос о функциональной полноценности этих клеток. Данные, характеризующие функциональную активность МСК при патологии, в частности, инфекционно-воспалительных и онкологических заболеваниях, немногочисленны и противоречивы - от постулирования функциональной полноценности МСК [Bocelli-Tyndall C, 2007, Larghero J, 2008] или нарушений отдельных функций при сохранности других [Varga G., 2007, Xishan Z., 2011, Li B., 2010] до признания полной дефектности МСК [Kastrinaki M., 2008, Perez-Simon J., 2009, Wu Y., 2008]. Поэтому сделать однозначное заключение об особенностях функционирования МСК при той или иной патологии на сегодняшний день не представляется возможным. При этом отсутствие информации об особенностях/нарушениях функциональных свойств МСК при патологии тормозит разработку подходов направленной коррекции активности этих клеток при использовании пациент-зависимых клеточных технологий.


Цель работы:

исследовать биологические, в том числе иммунорегуляторные, свойства МСК различного тканевого происхождения, а также костномозговых МСК в норме и при иммунопатологических заболеваниях и изучить влияние МСК на эффективность восстановления гемоиммунопоэза при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами.



Задачи исследования:

  1. Изучить количественное содержание, фенотип и дифференцировочный потенциал МСК различного тканевого происхождения (костный мозг, жировая ткань, плацента).

  2. Изучить регуляторную (иммуносупрессорную, гемопоэз-стимулирующую, цитокин-секреторную) активность МСК, выделенных из костного мозга, жировой и плацентарной ткани.

  3. Охарактеризовать количественное содержание, фенотип и дифференцировочный потенциал костномозговых МСК у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

  4. Изучить иммуносупрессорную, гемопоэзстимулирующую и цитокин-секреторную активность костномозговых МСК у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

  5. Исследовать возможные молекулярные механизмы, опосредующие иммуносупрессорную активность МСК костного мозга, в норме и у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

  6. Изучить влияние фактора роста фибробластов (FGFb) на дифференцировочный, иммуносупрессорный и цитокин-секреторный потенциал костномозговых МСК доноров в культуре in vitro и оценить возможность использования FGF для стимуляции роста и коррекции функциональной активности МСК при патологии.

  7. Изучить влияние МСК на восстановление показателей кроветворения и иммунную реконституцию у больных гемобластозами при проведении аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

  8. Оценить особенности клинического течения пострансплантационного периода (частота развития инфекционных осложнений, показатели выживаемости, купирование ПХТ-индуцированной токсичности и т.д.) у больных гемобластозами с аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток в комбинации с введением МСК.


Научная новизна.

Морфофункциональные исследования продемонстрировали, что выделенные из костного мозга, жировой и плацентарной ткани МСК соответствуют Минимальным критериям, продуцируют широкий спектр цитокинов с функциональным потенциалом для поддержания кроветворения, иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов, проявляют дозозависимую иммуносупрессорную и гемопоэзстимулирующую активность, однако характеризуются рядом различий. В частности, МСК жировой ткани отличаются максимальным количеством клоногенных предшественников МСК и наиболее высоким базальным уровнем цитокин-секреторной активности, популяция плацентарных МСК – наибольшей пролиферативной активностью и выраженным супрессорным эффектом на пролиферацию Т-клеток в СКЛ, костномозговые МСК – максимально выраженным остеогенным потенциалом и иммуносупрессорной активностью в отношении a-CD3-активированных Т-клеток.

Исследование свойств МСК при патологии (гемобластозы, аутоиммунные заболевания, хронические вирусные гепатиты с исходом в цирроз печени) позволило получить новые данные о сопряженности патологии со снижением в костном мозге количества клоногенных предшественников МСК, наиболее выраженным у больных лимфомами и АИЗ, и значительной вариабельности данного показателя у больных ЦП и АА. При этом установлено, что вне зависимости от количества клоногенных предшественников, культуры МСК больных отличаются сниженной скоростью роста и количеством «дочерних» клеток, генерируемых одной КОЕ-Ф. Впервые продемонстрировано, что развитие иммунопатологических состояний ассоциировано со снижением иммуносупрессорной активности МСК, которая проявляется только при высоких количествах МСК, в то время как низкие дозы МСК не влияют (при ЦП), либо усиливают (у больных АИЗ и гемобластозами) пролиферативную активность Т-клеток. Характерно, что супрессорная активность МСК при большинстве исследуемых патологий не коррелирует с продукцией NO, HLA-G, IL-10, IDO, но в значительной степени опосредуется ПГЕ2, а у больных АА существенно блокируется при нейтрализации IDO.

Впервые установлено, что добавление основного фактора роста фибробластов (FGFb) в культуры МСК больных воспалительными и онкогематологическими заболеваниями приводит к снижению длительности первичного культивирования МСК, увеличению выхода клеток и возрастанию числа клеток в S/G2M фазе клеточного цикла. При этом возрастание пролиферативной активности МСК в присутствии FGFb сопровождается повышением супрессорного потенциала МСК доноров и больных хроническими воспалительными заболеваниями (АИЗ, ЦП), однако не приводит к усилению супрессорной активности МСК больных гемобластозами. Кроме того, использование FGFb в процессе культивирования МСК позволяет повысить исходно сниженный остеогенный дифференцировочный потенциал МСК больных ЦП, но не влияет на остеогенную дифференцировку МСК больных гемобластозами.

Впервые продемонстрировано, что использование низких доз МСК при трансплантации аутологичных ГСК у больных злокачественными лимфомами безопасно, сокращает сроки критической нейтро- и тромбоцитопении, повышает эффективность раннего восстановления лимфоцитов и реконституции CD4+ лимфоцитов (в том числе за счет наивных CD4+ Т-клеток) при отсутствии стимулирующего влияния на восстановление регуляторных Т-клеток. Трансплантация низких доз МСК ассоциируется с меньшей частотой развития тяжелых форм поражения слизистых и не приводит к увеличению частоты возникновения рецидивов/снижению выживаемости больных.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные данные свидетельствуют о том, что наряду с общностью биологических свойств, МСК различного тканевого происхождения характеризуются рядом тканеспецифических особенностей, в частности, различаются по количеству клоногенных предшественников, пролиферативному и остеогенному потенциалу, а также продукции цитокинов и проявлениям супрессорной активности.

Выявленное снижение количества клоногенных предшественников МСК, их пролиферативной и супрессорной активности, а также остеогенного потенциала у больных воспалительными и онкогематологическими заболеваниями свидетельствует о сопряженности иммунопатологических процессов с количественными и функциональными изменениями в популяции МСК. При этом ПГЕ2 является универсальным медиатором супрессорной активности высоких доз МСК независимо от патологии. Установленная зависимость между усилением пролиферации МСК (при обработке FGFb) и восстановлением супрессорного потенциала МСК при воспалительных заболеваниях и отсутствие подобной зависимости при гемобластозах свидетельствует о существовании различных типов функциональных нарушений МСК.

Практическая значимость работы заключается в том, что впервые показана возможность коррекции нарушений функциональной активности МСК при иммунопатологических заболеваниях фактором роста фибробластов и различная чувствительность МСК больных воспалительными и онкогематологическими заболеваниями к действию FGFb. Важным прикладным аспектом работы являют данные о безопасности, переносимости и клинической эффективности внутривенного введения относительно невысоких доз аутологичных МСК. Оценка показателей кроветворения и содержания различных субпопуляций Т-лимфоцитов свидетельствует, что трансплантированные МСК in vivo не обладают иммуносупрессорной активностью, повышают эффективность восстановления гемопоэза и иммунной реконститутции и оказывают благоприятный эффект на исходы трансплантации. Результаты исследований использованы для разработки новой медицинской технологии «Использование совместной трансплантации мезенхимальных стволовых стромальных клеток и стволовых кроветворных клеток при гемобластозах и аутоиммунных заболеваниях» (ФС № 2008/014 от 30 января 2008 г).



Основные положения, выносимые на защиту:

  1. МСК различного тканевого происхождения имеют тканеспецифические различия по количеству клоногенных предшественников, пролиферативному и остеогенному потенциалу, а также продукции цитокинов, участвующих в поддержании кроветворения, иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов.

  2. Изменения свойств костномозговых МСК при гемобластозах, аутоиммунных заболеваниях и циррозе печени проявляются снижением количества клоногенных предшественников МСК, их пролиферативной и супрессорной активности, а также остеогенного потенциала в культуре in vitro.

  3. Основной фактор роста фибробластов повышает in vitro пролиферативную активность МСК больных с иммунопатологическими заболеваниями и у пациентов с аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени корригирует иммуносупрессорную активность и остеогенный потенциал МСК.

  4. Использование низких доз МСК (в диапазоне от 0,01 до 1,1 х106 клеток/кг) является безопасным и повышает эффективность трансплантации аутологичных ГСК у больных гемобластозами за счет сокращения сроков цитопении, более эффективной реконституции Т-клеток и снижения частоты тяжелых инфекционных осложнений (мукозитов, энтеропатий).

Апробация работы

Результаты доложены и обсуждены на Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik International» (Москва, 2004); на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет» (Новосибирск, 2005); на Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (С-Пб., 2005); на Всероссийских научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005; Красноярск, 2006; Омск, 2007; Томск, 2008; Красноярск, 2010); на Международной конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск, 2005); на 10-ом конгрессе ESPRAS (European Societies of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery) (Вена, 2005); на Международной конференции “Basic science for Biotechnology and Medicine” (Новосибирск, 2006); на Всероссийской и Международной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2007); на 3-ей международной конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2007); на Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); на II Съезде терапевтов Республики Казахстан (Алматы, 2009); на Всероссийской научной школе-конференции (Москва, 2010); на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010); на Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения» (Санкт-Петербург, 2010); на 7-ой и 8-ой отчетных конференциях НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2008, 2011); на 2-ой и 3-ей конференциях Международной ассоциации по нейрореконструкции (Пекин, 2009 и 2010); на 36-ой и 37-ой Annual Meeting of European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT) (Флоренция, 2008; Париж, 2011).



Публикации

По теме диссертации опубликовано 53 печатных работы, в том числе 18 статей в рецензируемых журналах, защищен 1 патент, зарегистрирована 1 новая медицинская технология



Объем и структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 182 страницах машинописного текста, включающего 28 таблиц и 24 рисунка. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 248 литературных источников, в том числе 240 иностранных.

Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии ФГБУ НИИКИ СО РАМН (зав. лабораторией – член-корр. РАМН, д.м.н., проф. Черных Е.Р.) в рамках темы НИР 030 «Молекулярно-генетические механизмы регуляции стволовых клеток и клеток-предшественников в норме и при иммунопатологических состояниях. Разработка высокоэффективных биотехнологических методов трансплантации стволовых клеток (в том числе генно- и цитокин-модифицированных) в лечении основных заболеваний человека» и темы НИР 037 «Разработка новых клеточных технологий в лечении онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека на основе изучения биологических свойств и молекулярно-генетических механизмов регуляции стволовых и иммунокомпетентных клеток».

Образцы тканей для получения МСК были любезно предоставлены д.м.н., проф. Добряковой О.Б. и к.м.н. Дробинской А.Н. Автор выражает искреннюю признательность коллективу Отделения гематологии и трансплантации костного мозга (зав. отделением – к.м.н. Крючкова И.В.), иммунологического отделения (зав. отделением – к.м.н. Старостина Н.М.) и всем сотрудникам лаборатории клеточной иммунотерапии НИИКИ СО РАМН.



МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Диссертационная работа основана на результатах исследования мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из костного мозга доноров (n=30) и больных (n=200) с различными иммунопатологическими заболеваниями, жировой (n=41) и плацентарной ткани (n=31).



Характеристика больных, включенных в исследование. В исследование были включены 147 больных гемобластозами (84 мужчины и 63 женщины, в возрасте от 8 до 56 лет, медиана 33 года), находившиеся на лечении в отделении гематологии и трансплантации костного мозга Клиники иммунопатологии ФГБУ НИИКИ СО РАМН. У 52 пациентов была диагностирована неходжкинская лимфома (НХЛ), у 46 – лимфома Ходжкина (ЛХ), у 28 – множественная миелома (ММ), у 21 больного - апластическая анемия (АА). В исследование также были включены 36 пациентов (26 мужчин и 21 женщина в возрасте от 15 до 64 лет) с циррозом печени (ЦП) различного класса тяжести по Child-Pugh (класс А, n=16; класс В, n=15; класс С, n=5). Кроме того, исследовали 17 пациентов (3 мужчин и 14 женщин в возрасте от 18 до 49 лет) с аутоиммунными заболеваниями, включая 10 - с системной красной волчанкой (СКВ), 2 – с ревматоидным артритом (РА), 3 – с аутоиммунным ЦП и 2 – с системной склеродермией (ССД).

Иммунологические исследования.

Получение и культивирование мононуклеарных и ядросодержащих клеток. Костный мозг получали путём трепанобиопсии из крыла подвздошной кости. МНК выделяли страндартно центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина. Ткань плаценты, полученную после физиологических родов (при наличии информированного согласия женщины), измельчали, отмывали в PBS и обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА/0,1% коллагеназы 1а типа (Sigma-Aldrich, США) в течение 40 минут. Жировую ткань получали в ходе операций эстетической хирургии, при наличии информированного согласия пациента. Липоаспираты отмывали в PBS 3-5 раз и обрабатывали 0,1% раствором коллагеназы 1а (Sigma-Aldrich, США) в течение 40 минут. Для получения популяции МСК костномозговые МНК и ядросодержащие клетки жировой/плацентарной ткани культивировали в среде α-MEM («БиолоТ», С-Пб) c 20% FCS («БиолоТ», С-Пб) в CO2-инкубаторе. Через 24 ч неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а фракцию адгезивных клеток культивировали до покрытия клетками 80-90% площади флакона. Пассирование МСК осуществляли с использованием 0,25% раствора трипсина (Sigma-Aldrich, США) и 0,02% раствора ЭДТА (ICN, США) в течение 5-10 минут. Интенсивность деления МСК оценивали по времени достижения конфлюэнтного роста в первичных культурах (1-й пассаж) и по количеству генерированных «дочерних» клеток в пересчете на 1 КОЕ-Ф.

Исходное количество клоногенных прекурсоров МСК в исследуемых тканях определяли по числу фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф). Для этого 1х106 МНК костного мозга или ядросодержащих клеток жировой ткани/плаценты культивировали в чашках Петри (Nunclon, Дания) в среде αМЕМ с 20% FCS в течение 14 суток. По окончании культивирования клетки окрашивали по Романовскому-Гимза, затем подсчитывали число колоний, содержащих не менее 50 фибробластоподобных клеток.



Морфометрию МСК проводили в мазках, окрашенных азур-эозином, с использованием компьютеризированной видеосистемы со встроенным интерфейсом (MicroMed Images 1.0) с последующей оценкой характера распределения клеток по величине их диаметра в интервале <10 — >60 мкм с шагом 10 мкм.

Оценку экспрессии поверхностных маркеров проводили методом проточной цитофлюориметрии на лазерном клеточном анализаторе FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием FITC- или PE-меченных моноклональных анти-CD3, -CD14, -CD16, -CD20, - CD34, -CD73, -CD90, -CD105, -HLA-DR антител. Для определения относительного содержания CD4+CD45RO+-, CD4+CD45RA+-, CD8+CD45RO+- и CD8+CD45RA+ Т-лимфоцитов, а также CD4+CD25high и CD4+FOXP3+ регуляторных Т-клеток использовали FITC-меченные анти-CD4, -CD8 и -CD25 («Сорбент», Россия) и РЕ-меченные анти-CD45RO, -СD45RA и FOXP3 моноклональные антитела (Becton Dickinson, США).

Оценка остеогенной и адипогенной дифференцировки МСК. МСК, полученные при первом пассаже, культивировали в индукционной среде, содержащей β-глицерофосфат, дексаметазон и фосфат аскорбиновой кислоты (остеогенная дифференцировка), либо дексаметазон, 3-изобутил-1-метилксантин и индометацин (адипогенная). В контрольных культурах клетки культивировали в стандартной среде. Через 18 суток оценивали эффективность дифференцировки МСК с помощью окраски по von Kossa в первом случае и Oil Red O (Sigma-Aldrich, США) во втором. Маркером остеогенной дифференцировки являлась продукция кальций-содержащего матрикса, окрашиваемого нитратом серебра в черный цвет, адипогенной – появление в цитоплазме клеток липидных вакуолей, окрашиваемых в красный цвет.

Полуколичественный метод оценки остеогенного потенциала МСК. Сравнительный анализ выраженности/интенсивности остеогенной дифференцировки МСК проводили в соответствии с разработанным нами ранее полуколичественным методом (Патент РФ № 2370771), основанном на измерении оптической плотности культур МСК в заданном диапазоне 2-х кратно возрастающих клеточных концентраций после их культивирования в остеогенной индукционной среде в течение 18 сут и окрашивания депозитов кальция по von Kossa. Интенсивность цветовой реакции оценивали на фотометре Multiskan Ascent (Thermo Electron Corp., Финляндия) при длине волны 492 нм. Интенсивность дифференцировки выражали в виде Индекса Остеогенной Дифференцировки, ИОД (отношение оптической плотности в опытных образцах к таковой в контрольных).

Исследование функциональной активности МСК. Определение концентраций цитокинов (IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, MCP-1 (MCAF), MIP-1β, TNF-α) в супернатантах конфлюэнтных и стандартизованных (50х103 МСК/лунку; 48 ч; в отсутствие/присутствии липополисахарида E.coli в дозе 10 мкг/мл; Sigma-Aldrich, США) культур МСК проводили на 2-хлучевом лазерном автоматизированном анализаторе BioPlex Protein Assay System (BioRad, США) с использованием коммерческих тест-систем Human Cytokine 17-Plex Panel. Методом ИФА оценивали содержание эритропоэтина (Pro-Con EPO-HS, Протеиновый контур, Россия), инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1, Diagnostic System Laboratories, США), основного фактора роста фибробластов (Human FGF basic, Biosource, Бельгия), эпидермального ростового фактора (Pro-Con EGF, Протеиновый контур, Россия), фактора роста эндотелия сосудов (Human VEGF Immunoassay Kit, Invitrogen, США) и HLA-G (sHLA-G ELISA, Exbio, Чехия)..

Влияние МСК на пролиферативный ответ активированных Т-клеток оценивали в анти-CD3-стимулированных культурах и двунаправленной смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ). Различные количества МСК (для получения соотношений 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:100) культивировали в течение 24 ч в питательной среде в плоскодонных 96-луночных планшетах. К созданному монослою добавляли МНК здоровых доноров. В случае двунаправленной СКЛ в лунки вносили по 0,1х106 МНК от двух доноров и культивировали в течение 5 сут в среде RPMI-1640 с 10% FCS. Митоген-индуцированный пролиферативный ответ оценивали в 3-суточных культурах МНК доноров (0,1х106/лунку), активированных анти-CD3 моноклональными антителами ICO-90 (анти-CD3, 1 мкг/мл, «Медбиоспектр», Москва). Интенсивность пролиферации оценивали по включению 3Н-тимидина. Контролем служил уровень пролиферативного ответа МНК в отсутствие МСК. В отдельной серии экспериментов МСК предварительно обрабатывали (45 мин, 370С) индометацином (100 мкг/мл) или ингибитором ИДО – 1-метилтриптофаном (1-МТ; 500 мМ).

Для оценки влияния МСК на экспрессию активационных молекул на Т-лимфоцитах МНК доноров, стимулированные моноклональными анти-CD3-антителами (1 мкг/мл), культивировали в отсутствие/присутствии МСК (в соотношении МНК:МСК=10:1) в RPMI-1640 с 10% FCS. Через 72 ч собирали неприкрепленные к пластику клетки, и методом проточной цитометрии оценивали относительное количество CD25+ и HLA-DR+ клеток в лимфоцитарном гейте.

Влияние МСК на колониеобразующую активность костномозговых гемопоэтических предшественников оценивали по количеству эритроидных, гранулоцитарно-макрофагальных и смешанных колоний, полученных в результате 14-дневного культивирования МНК костного мозга в отсутствие/присутствии МСК (1:1 и 1:10) в полужидкой метилцеллюлозной среде МethoCult (Stem Cell Technologies, Канада).

Ретроспективный анализ ко-трансплантации МСК и ГСК у больных злокачественными лимфомами. В исследование были включены 126 больных (72 мужчины и 54 женщины; от 8 до 56 лет), которым проводилась аутологичная трансплантация ГСК в отделении гематологии и трансплантации костного мозга Клиники иммунопатологии НИИ Клинической иммунологии СО РАМН. У 52 пациентов была диагностирована неходжкинская лимфома (НХЛ), у 46 – лимфома Ходжкина (ЛХ), у 28 больных – множественная миелома (ММ). Всем пациентам проводилась стандартная мобилизация, сепарация и трансплантация аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) после высокодозной химиотерапии, у 65 больных трансплантация ГСК была дополнена введением аутологичных МСК.

МСК генерировали из прилипающей фракции аспирата костного мозга в течение 17-20 дней согласно описанной ранее технологии [наша технология] с последующим криоконсервированием в растворе альбумина («Микроген», Россия), содержащем 10% DMSO (Sigma-Aldrich). Клетки размораживали непосредственно перед введением при 37°C, с использованием водяной бани, отмывали и вводили в 20 мл физиологического раствора внутривенно после трансплантации ГСК. Количество трансплантированных МСК варьировало от 0,01 до 1,1 х106 клеток/кг веса больного (медиана 0,17 х106 клеток/кг).

У всех пациентов оценивали абсолютное количество лимфоцитов до мобилизации, в продукте сепарации, после ТГСК (на момент выхода из лейкопении) и при выписке. Раннее восстановление лимфоцитов (РВЛ) считалось наступившим, если выход из цитопении (лейкоциты ≥ 1x109/L) наступал не позднее 15 дня после ТГСК, а количество лимфоцитов в периферической крови при этом составляло 500 и более клеток /мкл.

Относительное содержание CD4+CD45RO+-, CD4+CD45RA+-, CD8+CD45RO+- и CD8+CD45RA+ Т-лимфоцитов, а также CD4+CD25high и CD4+FOXP3+ регуляторных Т-клеток оценивали до ТГСК (перед началом кондиционирования) и после ТГСК на момент выписки из стационара (в среднем на 23-й день).



Статистическую обработку полученных результатов проводили методами описательной, параметрической и непараметрической статистики с использованием программ «STATISTICA 8.0» и «GraphPad 5.0».
  1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©zubstom.ru 2015
обратиться к администрации

    Главная страница