3D-биопринтинг



Скачать 159,83 Kb.
Дата29.06.2015
Размер159,83 Kb.

3D-биопринтинг


Дефицит человеческих органов для трансплантации является одной из критических и нерешённых проблем в клинической медицине. Каждый день в мире из-за нехватки донорских органов в среднем умирает 18 человек.

Регенеративная медицина – альтернатива донорским органам. К ней относят такие технологии, как генная и клеточная терапия и инжиниринг тканей.


3D-биопринтинг или создание (печать) живых тканей с помощью 3D-принтера - это относительно новая область в регенеративной медицине. Это так называемое биомедицинское применение послойной трёхмерной печати с целью решения проблемы получения копий живых органов [1].

Идея 3D-биопринтинга заключается в создании тканей и органов из конгломератов (беспорядочной смеси) живых клеток. Это можно осуществить с помощью специально созданных биопринтеров, «картриджи» которых заправлены сфероидами, т.е. смесью живых клеток, которые «капают» на своеобразную биобумагу или каркас и формируют живой орган [6].


Биопринтер способен печатать ткани и органы из клеток. Недавно в Москве открылась биотехнологическая частная лаборатория «3D Bioprinting Solutions», которая занимается биопечатью. По мнению профессора Университета Вирджинии, научного руководителя лаборатории «3D Bioprinting Solutions» Владимира Миронова, новая технология биопечати уже в недалеком будущем полностью избавит человечество от необходимости использовать донорские органы и решит проблему биологической совместимости пересаженных органов и тканей [7].

Во многих областях науки наблюдается переход от линейного к экспоненциальному росту знаний и технологий. То же самое происходит в регенеративной медицине. Особое значение приобретают такие технологии как биопринтинг, находящиеся на пересечении биомедицины, инженерных наук и информационных технологий.

Идея регенеративной медицины – восстанавливать поврежденные ткани и органы. Универсальный инструмент – стволовые клетки, обладающие уникальным потенциалом к развитию. Специалисты уже достигли больших успехов в клеточной трансплантации и тканевой инженерии, они научились выращивать некоторые органы в биореакторах, используя клетки и специальный каркас. Другая идея – не выращивать, а собирать орган из клеток, как трехмерный конструктор.

В основе развития биопечати лежит сочетание практических и теоретических знаний из разных областей науки: инженерного дела, механики, общей биологии, биологии развития, эмбриологии, биохимии, прикладной биотехнологии и информатики. Без объединения разносторонних специалистов прогресс в этой области невозможен.

Обычно под термином «регенеративная медицина» понимают развивающиеся биомедицинские технологии, такие как генная терапия, клеточная терапия и инжиниринг тканей и органов. Регенеративная медицина включает всё то, что помогает натуральному процессу заживления: это может быть генная и клеточная терапия, тканевая инженерия и инженерия на уровне органов или же печатание органов.

Внимание к 3D-биопринтингу в последнее время растёт. У этой технологии большое будущее. И хотя её только в прошлом году впервые включили в список 200 перспективных технологий, находящихся на стыке IT и медицины, работа над этим уже около десяти лет. В широком смысле, печать органов принадлежит к группе конкурирующих технологий, которые называются «инжиниринг органов». Таким образом, сверхзадачей исследований является построение человеческих органов, подходящих для имплантации, и 3D-биопринтинг используется как путь для достижения этой амбициозной цели, ведь инжиниринг живых человеческих органов есть конечная цель регенеративной медицины, – заявил профессор Университета Вирджинии, научный руководитель компании «3D Bioprinting Solutions» Владимир Миронов.

Существует четыре компании, занимающиеся биопринтингом зарубежом. Две в США, самая известная — это Organovo (San Diego, USA): они не только делают принтеры, но создают ткани и уже создали маленький кусочек печени. Другая компания только делает принтеры. Швейцарская компания (RegenHu) уже сделала два биопринтера — один лазерный, другой — «диспенсер» (дозатор). Они пытаются коммерциализировать биочернила, но фактически они называют этим словом гидрогель. Есть еще компания в Японии (CyFuse), но у них странная идея: они пытаются сделать орган, как делается шашлык, нанизывают сфероиды на жезлы.

Существуют компании, которые продают биопринтеры; компании, которые говорят, что они могут сделать органы (на первом этапе для фармакологической индустрии); компании, которые хотят использовать сфероиды для диагностики, для моделирования заболеваний и т. д. С этой точки зрения трехмерная биопечать — это уже не фантазия, это реальный бизнес.

Но ни один орган, напечатанный на 3D-принтере, ещё не был имплантирован человеку. Однако зарубежом есть около десятка разных случаев успешного имплантирования таких органов животным.

Технология.

Единица печати в биопринтере – не отдельные клетки, а сфероиды – конгломераты клеток в виде шариков, помещенные в гидрогель. Но для того, чтобы печатать, сфероиды надо сначала сделать, и это отдельная задача, которая уже решена. Роботизированные устройства производят такие сфероиды, капая суспензию клеток в микролунки. Устроены они по-разному и производительность у них тоже разная. Рекорд – 10 тысяч сфероидов в секунду. Для того чтобы напечатать орган, нужна 3D-модель органа («чертеж» или «блюпринт»). Орган – сложная структура, состоящая из разных тканей, пронизанная сетью кровеносных сосудов. Сделать компьютерную реконструкцию почки или печени – сложный процесс.

Процесс биопечати почти не отличается от технологии 3D-печати неживых объектов, которая в последнее время бурно развивается. Специалисты говорят о третьей технологической революции, основанной на 3D-печати. Можно напечатать практически любой предмет.

Другими словами, сфероиды – это своего рода «чернила» в биопринтере. Разные ткани строятся из разных сфероидов – для каждого свое отверстие в картридже. По 3D-модели принтер печатает один слой органа за другим. Сфероиды при этом не остаются отдельными элементами – они сливаются.

При сращивании сфероидов происходит компактизация ткани – например, почку придётся печатать раза в три больше, чем она будет внутри пациента – уже на последней стадии фабрикации она станет нормального размера.

Если использовать сфероиды, последовательно поместив их в слои гидрогеля с толщиной, равной диаметру сфероида, шарики склеиваются в горизонтальном и вертикальном направлении. Гель после деградирует, и остается трехмерная структура, которая в процессе создания уплотняется и не обнаруживает клеточной миграции (перемещения клеток). Это крайне важно, потому как дает возможность создать орган задуманной формы. Если бы клетки перемещались, создать орган не получилось бы [2].

В простейшем варианте получается подобие трубочки, сделанной из клеток, — это уже почти сосуд. Можно сделать капилляры, используя сфероиды с просветами. Можно делать и прямые, и ветвящиеся структуры — подобие капиллярных сетей настоящих органов (рисунок 1). Так было доказано, что создать орган с сосудистым руслом возможно, и это очень важно, ведь без кислорода и питания орган погибнет.

Рисунок 1 - Этапы формирования органа


Биопечать начинается с вложения в специальную машину части жировой человеческой ткани – через час в ней получаются аутологичные (не имеющие иммунных реакций) стволовые клетки человека, из которых можно делать любые ткани. Затем из них изготавливаются сфероиды — в специальных агрегатах имеется подложка с ямочками, куда заливается клеточная суспензия. Клетки образуют сфероиды за счет взаимодействия между собой. После, когда сфероидов достаточно, они помещаются в инкапсулятор, который вставляет шарики в оболочку из гиалуроновой кислоты — чтобы не слились раньше времени. И начинает работать биопринтер — робот с трехмерной системой позиционирования, проще говоря, со шприцем, которым он манипулирует в трехмерном пространстве. С помощью шприца сфероиды вводятся в гидрогель, используя трехмерную модель будущего органа.

После того как сфероиды выстроились в нужном порядке, гидрогель деградирует и получается нужный орган. Хотя это еще не совсем орган, а, скорее, инженерная конструкция в виде органа. Органом ее можно будет назвать, когда стволовые клетки дифференцируются. Для этого применяются вещества, именуемые ростовыми факторами. Когда дифференциация оканчивается, готовый орган можно помещать в организм. Отторжения органа не возникает — он сделан из собственных клеток пациента, т.е. он фактически его собственный.

Эксперименты показывают, что сегодня уже можно сделать кожу, хрящи. Неплохо создаются ушные раковины и печень — их даже пересаживали животным и органы приживались.

В итоге использование биопечати может стать решением проблем по иммунной совместимости органов. Также технология со временем откроется возможность создания прототипов органов и способов по замещению тканей, которые позволят трансплантировать здоровый орган пациенту. Это решит, наконец, проблему нелегальной торговли донорскими органами, больным не нужно будет проводить годы в ожидании, пока трансплантологи подберут подходящие им органы.

Планируется, что напечатанные органы сразу же будут атромбогенные – т.е. сосуды сразу же выстланы изнутри эндотелием. Эндотелий - специализированные клетки животных и человека, выстилающие внутреннюю поверхность кровеносных и лимфатических сосудов, а также полостей сердца. Это очень хорошее преимущество: орган не будет отторгаться организмом и пациенту не придётся всю жизнь принимать таблетки.

Кроме того, эта технология очень адаптивна, годится для применения в индустриальном масштабе и не зависит ни от тестов на животных, ни от доноров и не связана ни с какими этическими проблемами. И цена продукта со временем может стать невысокой.



Методы.

Биопринтинг — это не только одна технология. Сейчас преобладают 4 – 5 технологий. Можно взять жидкость, фоточувствительный гидрогель, можно порошок напылять и т. д. Весь биопринтинг можно разделить на две группы. Один вариант, когда из шприца или из диспенсера идет постоянная струя из клеток, и второй вариант, когда напыляется капельками. То есть или непрерывная, или прерывистая схема. Большинство используют стандартные существующие принтеры и вместо полимеров, которые используются в индустрии, берут биосовместимые полимеры и, печатая слои в разных направлениях, делают губку. Сначала это делали из полимеров, твердых как пластик. Потом решили взять вместо пластика гидрогель, потому что в гидрогель можно положить клетки. Но плотность клеток при таком способе низкая.

Технология, с использованием тканевых сфероидов, позволяет сразу получить высокую плотность клеток. К тому же, когда используется линейное поступление, то возможности для организации архитектуры очень ограничены. Хотя ухо таким образом можно сделать. Если у вас есть точечные структуры, такие как сфероид, то, как с мозаикой, можно нарисовать все что хочешь. С точки зрения геометрии и воспроизведения анатомический и гистологической структуры этот подход наиболее продвинутый.

Сначала были попытки использовать методы трехмерной печати для создания скаффолдов: использовали полимеры, керамику, даже титан, но это все без клеток. Скаффолд — это каркас, временная поддержка, которая используется для того, чтобы клетки прилипли к нему. Таким образом, создается форма, потом клетки начинают синтезировать матрицу и каркас деградирует.

Во-первых, каркас не нужен, сразу печатается живая ткань.

Во-вторых, в качестве каркаса используется мягкий гидрогель.

В-третьих, используется максимально возможная изначальная концентрация клеток.

Если просто смешать клетки с гидрогелем, то они будут находиться на большом расстоянии друг от друга. В тканевом сфероиде каждая клетка контактирует с пятнадцатью соседями, и этим достигается высокая плотность клеток, как в живой ткани.

Биопринтинг – это альтернатива «каркасному методу», когда используют твердый каркас органа, который засевают клетками, как делает Паоло Маккиарини, всемирно известный хирург, специалист по регенеративной медицине, проводя операции по выращиванию трахеи. Его технология уже успешно используется и спасает людей. Однако биопринтинг пока не опробован даже на животных.

Долгосрочная цель исследователей – раз и навсегда решить проблему нехватки органов. Больше всего необходимы печень и почки. Именно работа по изготовлению почки включена научной группой компании в качестве долгосрочного ориентира.

По прогнозам специалистов, первый полноценный орган (почка) можно будет ожидать к 2030 году. Стоить она сначала будет очень дорого, но с масштабированием технологии – в разы дешевле, чем чужие органы на пересадку сейчас.

Но есть и краткосрочная цель на пути к долгосрочной – создание трехмерных тканевых конструктов для тканевой инженерии [6].

По словам Миронова, уже разработан дизайн и идет поиск производителя. Появление первого прототипа российского биопринтера ожидается в 2014 году.

Перспективная цель лаборатории — печать человеческой почки. Именно донорских почек больше всего не хватает трансплантологам, чтобы сохранить жизнь миллионам людей, ждущих пересадки. Но на пути к этой цели есть промежуточные этапы.

После проверки функциональности клеток можно делать сложные конструкции. Например, из трубочек легко получается нефрон, а из множества нефронов – почка.

Сейчас инженеры и дизайнеры работают над созданием микрофлюидного устройства получения почечных нефронов, основные функции которой – фильтрация и реабсорбция. Первый этап этой работы – разработка искусственного нефрона на чипе.

Эта модель будет построена из клеток почечного эпителия, которые, в свою очередь, будут получены из индуцированных стволовых клеток. Как и нефрон в составе почки, она предназначена для фильтрации крови и получения мочи. Как объяснил руководитель лаборатории, доктор биологических наук Сергей Новоселов, такая модель нужна в первую очередь для тестирования новых лекарственных средств, поскольку ни испытания на животных, ни тестирование в клеточной культуре не могут совершенно точно предсказать, как лекарство поведет себя в человеческой почке. А модель нефрона сможет. С другой стороны, при ее создании ученые будут получать те же самые клетки, которые в перспективе можно будет использовать для печатания целого органа. Так что вторая цель модели нефрона — отработка клеточной технологии [7].

Сложные места реализации метода трёхмерной печати органов [4]:



  1. получение самих клеток. Очевидно, нужен материал для печати органа, например, жировая ткань пациента;

  2. получение модели органа. Нужно где-то взять схему 3D-модели органа;

  3. много проблем с формированием структуры органа;

  4. гипоксия (отсутствие кислорода) во время создания органа;

  5. реализации питания органа и его созревание до готовности.

Итак, 3D-принтер – это только часть линии по созданию органов: его нужно обеспечить 3D-моделью, материалом, а затем полученную модель органа из клеток вырастить и поддержать жизнеспособность.

Все вышеописанные задачи решаются следующим образом.


Модель органа. Итак, берётся CAD-файл с моделью органа. Проще всего получить модель, сделав трёхмерное сканирование самого пациента, а затем доработать данные вручную. Сейчас текущие схемы моделируются в AutoCAD (рисунок 2).


Рисунок 2 - Процесс моделирования. 3D-структура как у обычной детали – только вместо пластика - тканевые сфероиды.


Материал. Как уже говорилось, материал – это тканевые сфероиды, которыми будет осуществляться формирование органа из клеток. В качестве основы используется гидрогель, выполняющий функции соединительной структуры.


Тканевый сфероид — это группа клеток (15–20 тысяч), которые контактируют друг с другом и образуют трехмерную структуру.

Они имеют форму шара, и это очень важно с точки зрения биопечати, потому что для того, чтобы печатать с высокой точностью, строительные блоки должны быть максимально стандартизированы. Это самая удобная форма.

Теперь встаёт вопрос, где взять клетки для этого материала? Лучше – человеческие эмбиональные стволовые, из них можно сделать клетки для любой ткани последовательной дифференцировкой. Но их трогать, как известно, нельзя. Зато можно брать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Их можно сделать из костного мозга, пульпы зуба или обычной жировой ткани пациента – и их производят различные компании по всему миру.

Получается такая схема: человек обращается в клинику, делает липосакцию, жировая ткань замораживается и кладётся в репозиторий. При необходимости – достаётся, из неё делаются нужные клетки (один такой комплекс есть в России) и затем дифференцируются по назначению. Например, из фибробластов можно сделать стволовые клетки, из них – почечный эпителий, а дальше – функциональный эпителий. Машины для автоматического получения таких клеток производят, например, General Electric (рисунок 3).



Рисунок 3 - Центрифуга. Первый этап отделения материала из жировой ткани.

Сейчас идет тестирование метода на пластике. 3D-принтер печатает расходный материал, пластиковые приспособления – «молды» - это макет площадки для формирования сфероидов (рисунок 4).

Из клеток формируются шарики в специальных микроуглублениях на твёрдом материале. В углубление на молде помещается клеточная суспензия, затем клетки сращиваются и образуется шарик - сфероид.



Рисунок 4 – 3D-принтер, на котором печатают пластиковые молды



Обработка конструкционных блоков. Следующая проблема – клетки в картридже принтера могут слипнуться. Тканевые сфероиды должны быть изолированы друг от друга, иначе они начнут срастаться раньше срока. Их нужно инкапсулировать и для этого используется гиалуроновая кислота, получаемая из сыворотки крови.

Процесс печати. Головка 3D-принтера имеет три экструдера: две форсунки с гелем и устройство, выдающее тканевые сфероиды. В первой форсунке с гелем – тромбин, во второй – фибриноген. Оба геля относительно стабильны, пока не соприкасаются. Но когда белок фибриноген расщепляется тромбином, образуется фибрин-мономер. Именно им как бетоном скрепляются тканевые сфероиды. При глубине слоя, соответствующей диаметру сфероида, можно последовательно наносить материал слой за слоем (рисунок 5). Нанесли слой, закрепили, перешли к следующему. Затем фибрин легко деградирует в среде и вымывается при перфузии, и остаётся только нужная ткань.



Рисунок 5 - Формирование слоёв из сфероидов

Принтер печатает слоями по 250 микрометров: это баланс между оптимальным размером блока и риском гипоксии в сфероиде. За полчаса можно напечатать тканево-инженерную конструкцию 10х10 сантиметров – но это ещё не орган, а тканево-инженерная конструкция. Чтобы конструкция стала органом, она должна жить, иметь чёткую форму, нести функции.

Постобработка органа. Главный вопрос – это то, что клеткам необходимо иметь доступ к кислороду и питательным веществам. Иначе они начинают, грубо говоря, гнить. Чтобы созданный орган не испортился в процессе фабрикации, нужна микроциркуляция. Это делается печатью настоящих сосудов и капилляров, плюс с помощью тончайших перфузионных отверстий (перфузия – кровоснабжение), проделываемых неорганическими инструментами. Грубо говоря, конструкционные блоки поступают на полимерном «шампуре», который потом вынимается.


Будущий орган помещается в биореактор. Это, сильно упрощая, банка с контролируемой средой, в которой на входы и выходы органа подаются нужные вещества, плюс обеспечивается ускоренное созревание за счёт воздействия факторами роста.

Вот что интересно — архитектура органа обычно похожа на инкапсулированный объект – артерия входа, вена выхода – и много функций внутри. Предполагается, что биореактор позволит обеспечивать нужный вход и выход. Но это пока теория, собрать ещё не удалось ни одного. Но проект отработан до стадии «можно собирать прототип».

План развития технологии и исследований биопечати органов.

Первый этап - получение базовых элементов органов («материала»).

Второй – создание российского прототипа 3D-биопринтера с тремя экструдерами.

Третий – уход от прототипа к промышленной модели.

Четвертый - испытания на животных.

Пятый – клинические испытания.

Оборудование.

Для создания органа необходимо следующее оборудование, показанное на рисунке 6:



  1. клеточный сортер – при помощи этой установки из жира человека получают стволовые клетки и они сортируются;

  2. биофабрикатор тканевых сфероидов – создаётся материал, структура (сфероиды) для печати органа на биопринтере;

  3. биопринтер;

  4. перфузионная установка (биореактор) – созданный орган помещается в биореактор, в котором поддерживается доступ к ксилороду и питательным веществам, плюс ускоренное «созревание» органа.

Рисунок 6 – Оборудование, необходимое для создания органа

Для эффективного автоматизированного создания органа необходимы роботы. В бронхах, например, 10 порядков ветвления – собирать это вручную сложно и пациент не может долго ждать. Будущее технологии быстрой печати – это микрофлюидные экструдеры, которые делают до 10 тысяч капель в секунду. Вместе с быстрым роботом они могут дать отличный эффект.

И, как показывает практика, чем выше уровень автоматизации и роботизации, тем со временем продукция становится дешевле. Кроме того, этим методом можно печатать органы индивидуально под конкретного человека.

Если поставить технологию на поток, создать технологическую линейку — робот собирает клетки, робот образует сфероиды, робот печатает органы, и потом в биореакторе они созревают, — это будет выглядеть как сборка автомобиля по конвейеру.

Потребители. Первые крупные клиенты – военные. У них два применения – испытательное и лечебное. Например, солдата ранили, а до госпиталя далеко. Хорошо бы закрыть рану, снять боль, дать ему возможность стрелять ещё 5 часов, а затем на своих двоих прийти к медсестре. В теории возможны либо роботы, которые соберут всё это по месту, либо заплатки из человеческих тканей, которые уже сейчас всерьёз думают ставить на ожоги.


Второй клиент – фармацевтика. В этой сфере лекарства испытываются по 15 лет до выхода на рынок. Как шутят американцы, проще убить коллегу, чем мышку. На мышку надо собрать множество документов в руку толщиной. Сертифицированные мышки получаются в результате очень дорогие. Да и результаты по зверьку отличаются от человеческих. Существующие модели испытаний на плоских клеточных моделях и на животных не достаточно похожи. Примерно 7% новых лекарственных формул в мире не доходят до клинических испытаний из-за нефротоксичности, выявленной на стадии перед клиническими испытаниями. Из тех, что дошли, около трети имеют проблемы с токсичностью. Именно поэтому, одна из первых задач — проверка функциональности нефронов, сделанных в лаборатории. Ткани и органы с принтера будут существенно ускорять разработку лекарств, а это огромные деньги.

Третий клиент – госпитали. Рынок трансплантации почек в США, например, это 25 миллиардов долларов. Сначала предполагается просто продавать 3D-принтеры в больницы, чтобы пациенту могли трансплантировать нужный орган.

Большинство исследователей соглашаются, что регенеративная медицина является своего рода революцией. Печать органов - это одно из наиболее перспективных направлений в современной биомедицинской науке, использующее инновационные технологии.

У «3D Bioprinting Solutions» есть все необходимые компоненты, а главное, понимание того, чем они будут заниматься. Сейчас команда лаборатории работает сразу по нескольким направлениям [5]:

- конструирование и сборка российского биопринтера;

- перепрограммирование клеток;

- работа с клеточными культурами;

- получение фунциональных микротканей и многое другое.

Список литературы
1. Федеральный специализированный журнал «Кто есть Кто в медицине», №1(58), 2013 год, Наталья Лучкина [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://www.ktovmedicine.ru/news/2013/1/3d-bioprinting-revolyuciya-v-regenerativnoy-medicine.html. - (дата обращения: 01.11.2013).

2. Агентство по инновациям и развитию [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://www.innoros.ru/news/regions/13/09/trekhmernyi-printer-napechataet-lyuboi-organ. - (дата обращения: 02.11.2013).

3. Национальное географическое общество [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://www.rusngo.ru/index.php?option=com_content&view=article&id=3469. – (дата обращения: 02.11.2013).

4. Хабрахабр [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://habrahabr.ru/company/invitro/blog/194064/. – (дата обращения: 01.11.2013).

5. Сколково [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://community.sk.ru/press/b/weblog4/archive/2013/10/21/portrety-uchastnikov-otkrytyh-innovaciy-3d-bioprinting-solyushens.aspx. – (дата обращения: 03.11.2013).

6. Журнал «Наука и жизнь», статья «Напечатайте мне почку» [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://www.nkj.ru/news/21766/. – (дата обращения: 04.11.2013).



7. Журнал «Наука и жизнь», статья «Биопринтингом тканей и органов занялись в Москве» [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://www.nkj.ru/news/23148/.- (дата обращения: 04.11.2013).


База данных защищена авторским правом ©zubstom.ru 2015
обратиться к администрации

    Главная страница