Дифференциально-диагностические свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам бактерий pseudomonasaeruginosa 06. 02. 02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология



страница1/4
Дата29.06.2015
Размер0,61 Mb.
  1   2   3   4


На правах рукописи

ЧЖУН СИНЬ

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ БАКТЕРИЙ Pseudomonasaeruginosa

06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией

и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

МОСКВА 2015

Работа выполнена на кафедре «Ветеринарная медицина» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ ВПО «МГУПП») Министерства образования и науки РФ



Научный руководитель:

Ленченко Екатерина Михайловна,

доктор ветеринарных наук, профессор

ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств», профессор кафедры «Ветеринарная медицина»


Официальные оппоненты:

Куликовский Александр Витальевич,

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор

ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»), Главный научный сотрудник лаборатории «Молекулярной биологии»
Кондакова Ирина Анатольевна,

кандидат ветеринарных наук, доцент

ФГБОУ ВПО «Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А. Костычева» (ФГБОУ ВПО «РГАТУ§»), Заведующая кафедрой «Эпизоотологии, микробиологии и паразитологии»





Ведущая организация:

ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» (ФГАОУ ВО «РУДН»)



Защита состоится «01» июля 2015 г. в «12.30» часов на заседании диссертационного совета Д 212.148.09 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (109316, Москва, ул. Талалихина, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».

Автореферат разослан 2015 г.

Автореферат размещен на официальном сайте

Министерства образования и науки РФ http://vak.ed.ru/ 2015г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор ветеринарных наук, профессор Андрианова Т.Г.




  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бактерии Pseudomonas aeruginosa при инфицировании восприимчивых видов реализуют факторы вирулентности, связанные с синтезом экзотоксинов (гемотоксин, лейкоцидин, цитотоксины) и эндотоксина липополисахаридной природы, что обусловливает многообразие клинических проявлений болезней, вызываемых данной группой бактерий. Установлено, что популяции бактерий P. aeruginosa, выделенные из объектов внешней среды, характеризуются психрофильностью, метаболической пластичностью, ростом на обедненных средах с сохранением вирулентности (Рубан Е.Л., 1986; Сомов Г.П., Литвин В.Ю., 1988; Куликовский А.В. и соавт., 1990; Павлова И.Б., Ленченко Е.М., 1998; Марченко Т.В., 2006; Макаров В.В., 2008; Шестаков А. Г., 2010; Захарченко О.Н., Плешакова В.И.,2011; Николаева Н. В., 2011; Викторов Д.А., 2011; Пруцаков В.С., 2011; Рождественская Т.Н., 2011; Серегин И.Г. и соавт., 2011; Баженова Е.А., 2012; Пушкарева В.И., 2014). Экзополисахариды, продуцируемые бактериями P.aeruginosa в виде биопленок, обладают защитным эффектом от действия активного кислорода, что приводит к смене бактериями фенотипа в виде перехода в мукоидную форму, способствует изменению у таких форм способности окраски по Граму, при снижении метаболизма наблюдается переход популяции в «некультивируемое состояние» и этим осложняется бактериологическая диагностика, характеризующаяся длительностью и ретроспективностью исследования (Мележик И.А. и соавт., 2013; Ленченко Е.М., 2014; (Grametal., 2002;HuangMeizi. etal.,2003; ShenYing. etal.,2010; IrohaI. R. etal.,2011; DóraMárta, 2011; HeLanxiang, etal., 2012). При мониторинге и сборе информации распространенности возбудителей инфекционных болезней наблюдается статистически достоверная тенденция роста множественной лекарственной устойчивости бактерий (Кальницкая О.И., 2012; Панин А.Н., Куликовский А.В., 2014; Тарасова И.И. и соавт., 2014; АielloD. etal., 2010; BjarnsholtT., 2011). Учитывая социальную и экономическую значимость проблемы к числу приоритетных задач относится изыскание антибактериальных препаратов, эффективность которых определяется экологической безопасностью и широким спектром действия, в том числе, по отношению к бактериям P.aeruginosa с множественной лекарственной устойчивостью вследствие повышенного синтеза экзополисахаридов, формирующих биопленки, замедляющих диффузию антибактериальных препаратов (Чеботарь И.В. и соавт., 2012; HeXianyuan, 2014). Для углубления научных познаний малоизученных вопросов этиологической значимости факторов вирулентности P.aeruginosa целесообразным является изучение динамики патологических процессов на восприимчивых лабораторных моделях, апробация, изыскание и подборэффективных диагностических сред, тест-систем для дифференциации бактерий, экспресс-тестов изучения чувствительности к антибактериальным препаратам, что и определило актуальность темы диссертационной работы.

Цель работы: изучить дифференциально-диагностические антагонистические, патогенные свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам Pseudomonasaeruginosaдля оптимизации количественного учета, видовой идентификации и дифференциации сходных видов бактерий, выделенных из пищевого сырья и продуктов

Задачи исследований:

- изучить морфологию колоний бактерий Pseudomonasaeruginosa;

- апробировать и изыскать эффективные дифференциально-диагностические среды и тест-системы для оптимизации видовой идентификации бактерий Pseudomonasaeruginosa от сходных видов грамотрицательных бактерий;

- изучить патогенные свойства бактерий Pseudomonasaeruginosa;

- изучить антагонистические свойства бактерий Pseudomonasaeruginosa;

- изучить чувствительность бактерий Pseudomonasaeruginosa к антибактериальным препаратам

Научная новизна. Научно обоснована и экспериментально подтверждена эффективность применения селективной среды «Сetrimideagar» (специфичность – 94,8 %) для количественного учета, видовой идентификации и дифференциации бактерийP.aeruginosa. Цитопатическое действие бактерий Pseudomonas aeruginosa на ткани и органы птиц характеризуется сочетанием общей сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими изменениями паренхиматозных органов, признаками макрофагальных реакций, экссудативно-инфильтративными процессами тканей и органов иммунной системы. При изучении антагонистической активности бактерий установлено, что биологически активные вещества, продуцируемые P.aeruginosa, угнетали рост бактерий. При исследовании межвидового антагонизма, продуцируемые бактериями P.aeruginosa, угнетали рост бактерий S. enteritidis– 11,3±0,1; K. pneumonia– 11,0±0,3; C. freundii– 10,3±0,2; Y.enterocolitica – 10,0±0,2. Установлено, что 79,8 % культур микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, выделенные из пищевого сырья и продуктов, чувствительны к антибиотикам группы β-лактам (цефоперазон, цефотаксим, цефепим, азтреонам, имипенем, меропенем); 51,8 % – аминогликозидам (гентамицин, тобрамицин, нетилмицин), 88,4 % – хинолонам (норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин); 58,1 % устойчивы к хлорамфениколу, тетрациклину, доксициклину.

Практическая значимость работы. На основе изучения морфологии колоний Pseudomonasaeruginosaмодифицирована методика подготовки препаратов для микроскопического исследования колоний бактерий, результаты исследований по данной методике используются в учебном процессе на ветеринарно-санитарном факультете ФГБОУ ВПО «МГУПП» по дисциплинам: «Цитология, гистология, эмбриология»; «Эпизоотология».

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Ветеринарная медицина» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (Москва, 2011-2015 гг.); Материалы диссертации доложены на Международных научных конференциях студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2011; М., 2012).

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения морфологии колоний P.aeruginosa;

- результаты изучения дифференциально-диагностических свойств бактерий P.aeruginosa;

- результаты изучения патогенных свойств P. aeruginosa;

- результаты изучения антагонистических свойств бактерий;

- результаты изучения чувствительности P. aeruginosaк антибактериальным препаратам

Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликованы 5 работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.



Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, библиографии, приложений. Работа изложена на 127 страницах компьютерного текста, содержит 14 таблиц, 17 рисунков. Библиографический список включает 230 источник, из них 110 иностранных авторов.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена в период с 2011 по 2015 гг. на кафедре «Ветеринарная медицина» ФГБОУ ВПО «МГУПП», часть исследований проводилась в лаборатории «Санитарная микробиология» ФГБНУ «ВНИИВСГЭ§». В опытах были использованы паспортизированные штаммы: PseudomonasaeruginosaATCC 9027; P. fluorescens № 19; P. putida № 43; Salmonellaenteritidis № 204; Escherichia coliK88, №727; Klebsiella pneumonia №24; Citrobacter freundii №33/57; Enterobacter aerogenes CCM 2531; Yersiniaenterocolitica 09, №383; Staphylococcus aureus№ 123, полученные из коллекции ФГБУ «ВГНКИ», Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. При индикации и идентификации бактерий P. aeruginosa исследования проводили в соответствии с ГОСТ Р 54755-2011 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa» (М., 2012); «Методические рекомендации обнаружения и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях) (М., 1984). Пробы пищевых продуктов для бактериологических исследований отбирали в количествах, предусмотренных нормативными документами: ГОСТ 26668-85 (СТСЭВ 3013-81) «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологического анализа»; ГОСТ 10444.15-94 «Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов». Сравнительную оценку дифференциально-диагностических сред проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по организации и проведению контроля качества питательных сред для ветеринарных лабораторий» (М., 2011), используя среды: Хью Лейфсона – «HughLeifsonMedium» («Merck», Germany); Мак Конки – «MacConkey аgar»; «Хай Хром агар» («HiChromMedium») («HiMedia», India); Цефсулодин-Новобиоцин агар – Cefsulodin-Novobiocinagar» («CNagar»); Цетримид агар – «Cetrimideagar». Биохимические свойства бактерий изучали с использованием сред Гиса, тест набора для «MIKRO-LA-TEST», «ОКСИ-TEST» («Lachema», Czech). Идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами (Герхардт Ф. И соавт., 1984; Сидоров М.А. и соавт.,1995; Скородумов Д.И. и соавт., 2005). Патогенные свойства микроорганизмов оценивали с применением лабораторных моделей: эмбрионы уток породы "Пекинская" (n=12); цыплят породы «Белый леггорн» (n=12); белые беспородные крысы (n=12) общепринятыми методами (Биргер М.О., 1973). При гистохимическом исследовании срезы окрашивали для общих целей гематоксилином и эозином, соединительную и мышечную ткани – по Ван Гизону, на фибрин – по Шуенинову, на жир – суданом-3, на гемосидерин – пикрофуксином, на микроорганизмы – по Крантцу (Ленченко Е.М., 2009). Изучение чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам проводилив соответствии с «МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (М., 2004); ГОСТ Р 55481-2013 «Мясо и мясные продукты. Качественный метод определения остаточных количеств антибиотиков и других антимикробных химиотерапевтических веществ» (М., 2014). Гемолитическую активность микроорганизмов оценивали на МПА с содержанием 5,0 % стерильной крови млекопитающих и птиц (Лабинская А.С., 1984). Адгезивные свойства микроорганизмов изучали на эритроцитах млекопитающих и птиц (Павлова И.Б., Ленченко Е.М., 2010). Выражаем благодарность д-ру биол. наук, проф. Павловой И.Б. (ВНИВСГЭ) за оказание консультативной помощи при изучении популяции бактерий P. aeruginosaпри сканирующей электронной микроскопии «Hitachi-800» со сканирующей приставкой (Japan). Для получения репрезентативной информации морфологических исследований применяли оптический микроскоп «H604 TrinocularUnico» (USA); стереоскопический микроскоп «БИОМЕД МС–1 Стерео» (Россия). Экспериментальные данные подвергали статистической обработке (Ашмарин И.П., Воробьев Л.А., 1962; Садовский Н.В., 1975), с использованием программы «Statistika» для PCMicrosoftExcel 2007.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Результаты исследований морфологии колоний

бактерий Pseudomonasaeruginosa


При культивировании бактерий P. аeruginosaна МПА, «CNagar» «Cetrimideagar» через 18 – 48 ч при 37 °С выявило формирование S-R-M форм колоний. S-формы колоний имели округлую форму, были прозрачными, с ровными краями, d=2,0-5,0 мм; R-формы – плоские неправильной формы, складчатые, непрозрачные, с шероховатыми краями, d≥3,0 мм; карликовые, d≤1,0 мм; М-формы – мукоидные (слизистые), d=1,5 – 3,0 мм (табл. 1).

Таблица 1

Морфология колоний P. aeruginosa


Морфология колоний

Частота встречаемости, %

«МПА»

«CN agar»

«Cetrimide agar»

S-формы: круглые, прозрачные

50,1

6,2

88,0

R-формы:

- плоские неправильной формы


33,4

3,1

7,2


-складчатые

8,4

0

4,8

- карликовые

0

36,5

0

М-формы: мукоидные (слизистые)

6,7

54,2

0

Для изучения морфологии колоний препараты фиксировали в течение 3 мин в этиловом спирте, после подсушивания на поверхность колонии наносили 3 – 5 капель 1,0 %-ного водного раствор метиленового синего или водного раствора кристаллвиолета в разведении 1:2000. Для сохранения естественной архитектоники колоний препараты фиксировали парами 25,0 % раствора глутарового альдегида в течение 30 – 40 мин, для контрастирования применяли пары 1,0 % раствора осмиевой кислоты (OSO4) в течение 1–2 мин, после обработки колонии приобретали коричневый цвет.

Для исследования колоний бактерий при сканирующей электронной микроскопии применяли метод культивирования бактерий на мембранных фильтрах «Владипор, №5, №2», фиксировали парами 25,0 % раствора глутарового альдегида в течение 30-40 мин, для дополнительного контрастирования применяли пары 1,0 % раствора осмиевой кислоты (OSO4) в течение 1–2 мин, после обработки колонии приобретали темно-коричневый цвет, что позволило подсчитывать количество колоний, в том числе очень мелких (≤1,0 мм). При изучении морфологии популяции бактерий без нарушения архитектоники колоний выявили морфологические изменении на уровне популяции бактериальных клеток, что связано с диссоциацией, частичной или полной потерей бактериями клеточной стенки, разрушением предшественников синтеза нуклеиновых кислот и ферментативной системы. При благоприятных условиях нестабильные L-формы способны реверсировать в исходное состояние, так, через 7–10 суток реверсировавшие культуры визуально формировали нетипичный рост мелких, уплощенных закрытых тонкой слизистой биопленки. При нарушении структуры бактериальных клеток и перехода популяции P. aeruginosa в гетероморфизм с различными проявлениями L-трансформации образуются сферопласты или протопласты округлой формы различной величины, а также нестабильные и стабильные L-формы.Разработанная методика изучения популяции бактерий без нарушения архитектоники колонии, позволила выявить морфологические изменении на уровне структуры бактериальных клетокP. aeruginosa, проявляющаяся диссоциацией на S-, R-, М-формы колоний: S-формы имели типичную для вида палочковидную форму и гладкие края колоний; у R-форм наряду с типичными для данного вида бактериями по морфологическим критериям выявлен гетероморфизм; М-формы представлены сливными слизистыми колониями под массивными покровами (биопленками).

3. 2. Результаты изучения дифференциально-диагностических свойств бактерий Pseudomonasaeruginosa

Для подбора эффективных дифференциально-диагностических сред изучали ростобеспечивающие, ингибирующие свойства, специфичность сред: «HughLeifsonMedium»;«MacConkey аgar»; «HiChromMedium»; «CNagar» и «Cetrimideagar» культивировали 24 – 48 ч при 37 °С. При оценки ростообеспечивающих свойств сред взвесь микроорганизмов, содержащих около 1000 бактериальных клеток в 1 мл (стандарт мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича), высевали по 0,1 мл на поверхность сред, среднее количество колоний P. aeruginosa составило 64,15±1,35 – 81,33±1,63; энтеробактерий 42,17±1,37 – 90,17±1,47 (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительная оценка ростообеспечивающих свойств сред (М±m)


Бактерии

Количествовыросшихколоний, КОЕ

«Hugh

Leifson Medium»



«Mac Conkey аgar»

«Hi Chrom Medium»

«CN agar»

Cetrimide agar»

P. aeruginosa

-

-

-

74,15±1,35

86,25±2,31

81,33±1,63

64,15±1,35

84,15±1,35

-

S. enteritidis

-

-

-

-

-

90,17±1,47

69,15±2,15

80,17±1,44

E. coli

70,0 ±1,41

72,15±1,10

75,0 ±1,41

-

-

-

-

-

K. pneumoniae

79,67±0,89

-

-

-

-

-

77,66±0,69

79,67±0,89

Y. enterocolitica

-

-

-

70,17±1,27

-

62,17±1,37

54,13±1,37

42,17±1,37

-

C. freundii

78,0 ±1,12

76,0 ±1,1

-

-

73,25±1,3

-

-

76,0 ±1,21

Примечание: числитель – «+»; знаменатель – «-»

При оценке ингибирующих свойств сред в опытах со смешанной суспензией микроорганизмов установлено, что на среде «Cetrimideagar» среднее количество колоний P. аeruginosa и C. freundiiсоставило: 41,2±2,1/39,2±3,7 (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительная оценка ингибирующих свойств сред (M±m)



Среда

Количество колоний микроорганизмов КОЕ

P. аeruginosa

P. fluorescens



P. аeruginosa

P.putida


P. аeruginosa

S.enteritidis



P. аeruginosa

Е.coli


P. аeruginosa

C. freundii



«Hi Chrom Medium»

41,3±2,6

39,4±1,7


39,10±2,67

41,17±2,40



33,2±3,9

37,23±1,20



45,7±2,13

47,6±3,5


40,3±3,4

35,4±2,7


«Cetrimide agar»

42,3±3,7



47,3±3,3



47,3±3,3



41,60±1,96



41,2±2,1

39,2±3,7

Условные обозначения: «–» нет роста микроорганизмов


Для оценки специфичности сред (отношение количества идентифицированных культур микроорганизмов от общего числа типичных для вида колоний) проводили опыты со смешанными суспензиями микроорганизмов P. aeruginosa, S. enteritidis, E. coli, K. pneumonia, Y. enterocolitica, C. freundiiсодержащими 1 млрд. бакт. клеток в 1 мл (стандарт мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Суспензии культур микроорганизмов в объеме по 30 мл вносили в стерильные полиэтиленовые пакеты («NascoWHIRL-PAK», Germany), содержащие по одной куриной голени, выдерживали при комнатной температуре в течение 15 мин, периодически встряхивая. Затем голени переносили в полиэтиленовые пакеты, содержащие по 50 мл пептонной воды и выдерживали в течение 15 мин. Для выделения чистой культуры микроорганизмов суспензию из пакетов высевали по 0,1 мл на поверхность дифференциально-диагностических сред, культивировали при 37 °С 24 ч. При видовой идентификации типичных для семейства Pseudomonaceaeизолированных колоний, исследовали морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов. При оптической микроскопии в мазках, окрашенных по Граму P. aeruginosa были представлены грамотрицательными бактериями, длиной 0,5 – 1,4 мкм и шириной 0,2 – 0,4 мкм. При наличии грамотрицательных палочек аэробные (расщепление глюкозы путем окисления с образованием кислоты без газа – окислительно-ферментативный тест Хью-Лейфсона), оксидазаположительные, каталазаположительные культуры микроорганизмов пересевали в пробирки со скошенным МПА для изучения ферментативных свойств. Культуры микроорганизмов P. aeruginosa– восстанавливали нитрат в нитрит, обладали протеолитической активностью (разжижали желатин и свернутую кровяную сыворотку, гидролизовали казеин), свертывали лакмусовое молоко и расщепляли сгусток, не ферментировали мальтозу, не образовали индол, сероводород.

При культивировании микроорганизмов на средах «HughLeifsonMedium», «MacConkey аgar» и «CNagar» за счет наличия достаточно часто встречающегося фермента (лактоза, глюкоза, маннит), специфичность сред для идентификации псевдомонад относительно невысокая от 21,4 до 66,6%, не позволяло дифференцировать P.aeruginosaот сходных видов бактерий. Для дифференциации бактерий рода Pseudomonas специфичность среды «HiChromMedium» выше по сравнению с предыдущими средами 80,0 % за счет выявления специфического фермента «β-глюкозидаза» и «β-галактозидаза», P. аeruginosa, S. enteritidisи C. freundiiне продуцировали данные ферменты, формировали бесцветные колонии; K. pneumoniae, Y. enterocolitica продуцировали фермент «β-глюкозидаза», формировали сини-зеленые колонии, а E. coli продуцировали фермент «β-галактозидаза», формировали фиолетовые колонии.

  1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©zubstom.ru 2015
обратиться к администрации

    Главная страница