Особенности проявления цитробактериоза, кандидамикоза у рыб и санитарная оценка рыбопродуктов 16. 00. 03. ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология



страница1/3
Дата29.06.2015
Размер0,66 Mb.
  1   2   3


На правах рукописи

ОЖЕРЕДОВА НАДЕЖДА АРКАДЬЕВНА


ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ ЦИТРОБАКТЕРИОЗА,

КАНДИДАМИКОЗА У РЫБ И САНИТАРНАЯ ОЦЕНКА

РЫБОПРОДУКТОВ

16.00.03. – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора ветеринарных наук

Ставрополь − 2008


Работа выполнена в ФГОУ ВПО

«Ставропольский государственный аграрный университет»




Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, доктор

биологических наук, профессор



Дмитриев Анатолий Федорович


Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Тимченко Людмила Дмитриевна
доктор ветеринарных наук, профессор

Малышева Людмила Александровна
доктор ветеринарных наук, профессор

Филиппов Николай Васильевич

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Кубанский государственный

аграрный университет»


Защита состоится 23 декабря 2008 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д. 220.062.02 при ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет», по адресу: 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический 12.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет».

Автореферат разослан «____» ________________2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Квочко А.Н.


  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы. Повышение жизненного уровня населения нашей страны, его обеспечение всеми необходимыми продуктами питания, а также безопасность продовольственного сырья и пищевой продукции является одной из важнейших задач на современном этапе. В решении этой проблемы существенное значение приобретает увеличение производства и потребления рыбы, которое к настоящему времени сократилось в 2 раза по сравнению с 1990 годом. Вместе с тем, ее производство всегда оказывалось в 2-3 раза дешевле в сравнении с мясом. В то же время по своей питательной ценности рыба мало уступает мясу сельскохозяйственных животных, а по степени усвояемости в организме человека значительно превосходит говядину. Вместе с тем, дальнейшему увеличению и сохранению запасов промысловых и прудовых рыб в последние годы в значительной степени препятствуют почти ежегодные вспышки новых, недостаточно изученных инфекционных заболеваний рыб, названных краснухоподобными (жаберными), ранее не регистрировавшихся в российских водоемах и обусловливающих массовую гибель рыб.

Вспыхнувшие в середине 50-х годов прошлого столетия указанные эпизоотии среди холодноводных в сравнительно короткое время довольно быстро охватили прудовые карповые хозяйства, расположенные в различных климатических зонах, начиная от северо-запада и центральной черноземной полосы до Северного Кавказа, от Волго-Каспийского региона до Западной Сибири. Однако, несмотря на проводимые исследования, природа этих заболеваний до сих пор остается невыясненной. Изучением этой патологии занимались ряд исследователей (А.Ф. Вылегжанин, 1964; Е.С. Цой, 1978; В.Д. Ящук, 1988; Валедская А.М., 1991; М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Б. Федотов,1995; В.И. Афанасьев, Л.И. Лаврентьева, Г.В. Афанасьев, Г.И. Сапожников, 1997; K.В. Бурлаченко, Л. И. Бычкова, 2003; Л.В. Ларцева, Я.М. Болдырева, 2004;С.Г Виноградова, Е.М. Харенко, 2005; О.В. Казимирченко, 2006; N. Tereza et al, 1980; D. Guston, B. Austin, 1990; Carunsagar, 1992). Однако роль С. freundii в патологии рыб до сих пор остается неясной.

В рыбохозяйственных водоемах, и в частности, в прудовых хозяйствах, отмечается заболевание рыб кандидамикозом (З.Г. Бахтиярова, 1987; С.В. Петрович и Н.В. Войнова, 1989; Ларцева Л.В., 2004). Вместе с тем, несмотря на отдельные исследования, специфика проявления указанного заболевания, механизм заражения рыб возбудителями этой болезни также до сих пор остаются недостаточно изученными.

На фоне вспыхнувших эпизоотий краснухоподобных (жаберных) заболеваний рыб в ряде регионов прикаспийской зоны и в частности, в Астраханской области и других зонах, среди населения, употреблявшего в пищу пораженные рыбные продукты, стали отмечаться вспышки пищевых заболеваний невыявленной этиологии. По данным ФАО, на долю эпидемий рыбного происхождения ежегодно приходится до 20-35% от общего количества вспышек пищевых заболеваний наблюдаемых в мире.

В связи с нередким выделением из организма рыб, пораженных краснухоподобными (жаберными) заболеваниями, цитробактерий и дрожжеподобных грибов рода Саndida, серьезной опасностью их отдельных представителей, таких как С. freundii и С. аlbicans для организма человека, были проведены специальные исследования по изучению степени контаминации указанными микроорганизмами рыбы и рыбных продуктов, а также степени их патогенности. Тем более, что в специальной научной литературе имеются указания об опасности С. freundii, выделяемых из других видов пищевых продуктов, для организма человека. О возможности цитробактерий, в том числе и С. freundii вызывать пищевые заболевания у людей сообщали В.П. Рагинская, 1973; А.А. Покровский, 1985; С.А. Шевелева, Н.Р. Ефимочкина, А.А. Иванов, Н.П. Турурушкина, Т.И. Фролочкина, 2004; а на способность гриба С. аlbicans обусловливать одноименное заболевание кандидамикозом у человека указывали П.Н. Кашкин, 1958; Н.П. Елинов, 1964; А.М. Ариевич, З.Г.Степанищева, 1965;Е.Н. Морозов, 1971; В.Н. Кулага, 1974; Р.Н. Реброва, 1979.

Ряд исследователей (Е.В. Себряков, 1985; Т.Т. Сутеева, 1987; Л.В. Ларцева, 2004) выявили высокую обсемененность грибами рода Candida отдельных видов пищевых продуктов животного происхождения и указывают на их эпидемиологическую опасность в возникновении кандидамикоза у детей при употреблении в пищу таких продуктов. Однако вопрос о распространения цитробактерий и дрожжеподобных грибов рода Саndida, обнаруживаемых в рыбе, пораженной кранухоподобными (жаберными) заболеваниями, до настоящего времени предметно не изучался.



Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явилось изучение роли цитробактериоза и кандидамикоза в этиологии краснухоподобных (жаберных) заболеваний рыб, особенностей проявления этих заболеваний у рыб, санитарная оценка рыбопродуктов, контаминированых цитробактериями и грибами рода Candida.

При решении этой цели с учетом степени изученности проблемы были поставлены следующие задачи:

1. Провести эпизоотический мониторинг в рыбохозяйственных водоёмах России и в Ставропольском крае по изучаемым заболеваниям рыб.

2. Изучить особенности клинического, патоморфологического проявления цитробактериоза и кандидамикоза рыб.

3. Изучить биологические свойства цитробактерий и грибов рода Candida, выделенных у карповых рыб.

4. Выяснить устойчивость С. freundii и гриба С. аlbicans к физико-химическим факторам и антибиотикам.

5. Разработать систему диагностических, лечебно-профилактических мероприятий при цитробактериозе и кандидамикозе карповых рыб.

6. Провести санитарную оценку рыбы и рыбных продуктов при цитробактериозе и кандидамикозе.



Научная новизна работы. Впервые нами были выяснены источники распространения цитробактерий в российских водоемах, особенности клиникого, патоморфологического проявления цитробактериоза и кандидамикоза рыб, изучена специфика биологических свойств возбудителей этих болезней, патогенность которых подтверждена экспериментально заражением подопытных рыб и белых мышей.

Выявлена восприимчивость подопытных рыб к возбудителям цитробактериоза при трех температурных режимах (+5оС +7оС, +15оС +17оС, +20оС +25оС), при семи способах заражения (водном, пероральном, жаберном, кожном, внутримышечном, интраперитониальном, контактном) и впервые была доказана возможность заражения этими микроорганизмами подопытных растительноядных рыб (пестрых толстолобиков). Аналогичные эксперименты по заражению подопытных рыб были проведены и с возбудителями кандидамикоза, которые показали положительные результаты, особенно при водном и пероральном способах их заражения.

Выяснены условия роста и размножения возбудителей цитробактериоза и кандидамикоза, их отношение к различным физическим (высокой и низкой температуре) и химическим факторам, разработаны методы диагностики, включающие дифференциацию изучаемых заболеваний.

Впервые дана полная санитарная характеристика рыбных продуктов, контаминированых цитробактериями и дрожжеподобными грибами рода Саndida.

Совокупность выполненных нами исследований является актуальной научной разработкой, направленной на сохранение запасов промысловых рыб, повышение их продуктивности и качества рыбной продукции.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате комплексных исследований нами получены теоретические и практические данные по цитробактериозу и кандидамикозу рыб, на основании которых можно устанавливать комплексный диагноз указанных заболеваний карповых рыб с учетом результатов анализа эпизоотической ситуации, особенностей клинических, патоморфологических проявлений заболеваний, биологических свойств возбудителей болезней и осуществлять проведение дифференциальной диагностики цитробактериоза и кандидамикоза рыб от сходных болезней, что позволит успешно проводить лечебно-профилактические мероприятия. Представленные сведения по санитарной оценке способствуют улучшению качества рыбопродуктов.

Основные аспекты практического использования результатов изложены в методических рекомендациях по диагностике, терапии и профилактике болезней рыб (цитробактериоза и кандидамикоза), утвержденных в РАСХН 1 июля 2008 г., одобренных секцией «Инфекционной патологии животных» Отделения ветеринарной медицины (протокол № 3 от 27 сентября 2007 г.), а также в методических рекомендациях «Диагностика цитробактериоза рыб», «Диагностика кандидамикоза рыб», одобренных секцией животноводства и ветеринарии научно-технического совета МСХ Ставропольского края (протокол №2 от 10 марта 2006 г.).

Результаты исследований могут быть использованы в практической деятельности сотрудниками ветеринарных лабораторий, рыбоводами, фермерами, специалистами интересующимися вопросами инфекционной патологии, при составлении руководств, учебных и справочных пособий.

Основные положения, выносимые на защиту:

– Одной из причин вспышек краснухоподобных (жаберных) заболеваний рыб в рыбохозяйственных водоемах России, в том числе Ставропольском крае являются возбудители цитробактериоза, кандидамикоза или их ассоциативное проявление.

– Особенности клинического, патоморфологического проявления цитробактериоза и кандидамикоза у рыб.

– Возбудители цитробактериоза и кандидамикоза – C. freundii, C. albicans, имеют характерные биологические свойства, при экспериментальном заражении вызывают заболеваемость и летальность особей.

У рыб инфицированных цитробактериозом и кандидамикозом снижаются товароведческие показатели, а технологическая обработка тушек обеспечивает их обезвреживание.

Реализация результатов исследований. Результаты полученных исследований внедрены в рыбоводных хозяйствах Ставропольского края (ООО «Лотос», ЗАО «Голубая Нива», рыбколхоз «Зеркальные пруды», прудах с. Арзгир у индивидуального предпринимателя Геращенко А.Д.), а также в ГУ «Кропоткинская зональная ветеринарная лаборатория» и сельскохозяйственном кооперативе – рыболовецкая артель «Гулькевическая» Краснодарского края.

Кроме того, материалы диссертационной работы используются в учебном процессе по курсу микробиологии на кафедрах Ставропольского государственного аграрного университета, Московской ГАВМиБ им. К.И. Скрябина, Донского государственного аграрного университета, Новосибирского государственного аграрного университета, Костромской государственной сельскохозяйственной академии, Карачаево-Черкесской государственной технологической академии, Калмыцкого государственного университета, Дагестанской государственной сельскохозяйственной академии, Кубанского государственного аграрного университета.



Апробация работы. Основные положения и результаты исследований диссертационной работы доложены и одобрены на научных конференциях Ставропольского государственного аграрного университета (1993, 1996, 2001, 2004, 2005, 2007), Алтайском (1995, 1996, 1998, 2000, 2002), Краснодарском (1996) и Башкирском (1999) государственных аграрных университетах, Российской академии сельскохозяйственных наук (1996), Бурятской сельскохозяйственной академии (1998), Калмыцком государственном университете (2003), Вятской сельскохозяйственной академии (2005).

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации изложены в 44 работах, опубликованных в тематических сборниках, материалах конференций, 3 рекомендациях. В центральных научных журналах опубликовано 7 статей, издана 1 монография.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 360 страницах, содержит 79 таблиц, 19 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и предложений. Список литературы включает 383 источника, в том числе 111 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнялась на кафедрах эпизоотологии и микробиологии, анатомии и гистологии, патологической анатомии и ветсанэкспертизы, в межфакультетской биохимической лаборатории Ставропольского государственного аграрного университета, в прудовых хозяйствах и естественных водоемах Ставропольского края, стационарно неблагополучных по изучаемым заболеваниям, а также в отдельных рыбохозяйственных водоемах других областей Северного Кавказа, при возникновении эпизоотии. В Ставропольском крае в процессе проводимых исследований использовали рыбу, выловленную из 6 прудовых хозяйств и 5 естественных водоемов. В каждом рыбохозяйственном водоеме Ставрополья взятие материала проводили в течение трех и более лет, в весенний, осенний, летний, а иногда и в зимний периоды года. Основными объектами исследований являлись различные виды карповых рыб (карп, карась, толстолобики). Исследованию подвергали преимущественно товарную рыбу в период ее массового вылова. Всего в процессе проведения исследований в рыбохозяйственных водоемах, стационарно неблагополучных по изучаемым заболеваниям было исследовано только в прудовых хозяйствах 22 084 экземпляров карповых рыб, в том числе 9 892 на наличие цитробактериоза и 12 192 – кандидамикоза, морфологическому исследованию – 244, бактериологическому – 171, микологическому – 334 экземпляра рыб. При экспериментальном заражении и наблюдении было использовано 353 экземпляра подопытных рыб (карпов и пестрых толстолобиков), 144 лабораторных животных (белых мышей). В процессе проведения морфологического, химического и аминокислотного состава тушек пораженных рыб, было проведено 252 анализа мяса, а при выяснении устойчивости цитробактерий и грибов рода Саndida к различным физико-химическим факторам, в том числе тепловой, холодильной обработке и посолу, было выполнено 32 эксперимента. Взятие материала для бактериологического, микологического и других методов исследования проводили от пораженных рыб в рыбоводных хозяйствах, стационарно неблагополучных по цитробактериозу и кандидамикозу. Отбор проб проводили на месте с первичным высевом материала на питательные среды и брали их только от тех живых пораженных рыб, которые имели специфические для заболеваний клинические и морфологические изменения или же доставляли их в живом виде в лабораторию в зависимости от складывающихся условий. При взятии проб соблюдали правила асептики. В питательные среды в процессе проведения микологического исследования добавляли растворы пенициллина и стрептомицина по 200-250 ЕД на 1 мл каждого препарата.



Бактериологическое исследование рыб на наличие С. freundii.

При проведении бактериологического исследования, на наличие указанного вида микроорганизма, были использованы карповые рыбы, выращенные в 3 прудовых хозяйствах стационарно неблагополучных по цитробактериозу – Сергиевское (СПК «Александровское»), Донское (ООО «Волна»), Курсавское (СПК «Курсавский») и в 3 естественных водоемах (оз. Восточный Маныч, Отказненское и Чограйское водохранилища), имевшие специфические клинические и патоморфологические изменения для цитробактериоза. К этим признакам относились более рельефно выраженное кроваво-красное окрашивание поверхности тела рыб, геморрагическое поражение внутренних органов и наличие изъязвлений слизистой нисходящего отдела кишечника, а также проявление некроза жаберного аппарата. Выделение и идентификацию культур цитробактерий проводили в соответствии с методическими указаниями А.А. Покровского (1985) и других исследователей. Первичные высевы материала высевали на среды Симонса с цитратом натрия и инкубацией в термостате в течение 24-48 часов при температуре +25оС +26оС. После выделения чистой культуры проводили пересевы на среду Эндо, агар Плоскирева, висмут-сульфитный агар. Морфологию цитробактерий определяли в мазках окрашенных по Граму, а подвижность бактерий выявляли в висячей капле. Ферментативную активность определяли на углеводах (глюкозе, сахарозе, лактозе, маните, мальтозе, сорбите, ксилозе, рамнозе, инозите и арабинозе, выявляли отношение к ß-галактозидазе, мукату). Изучали гемолитические, протеолитические и толерантные свойства. Воспроизводили реакции на индол, сероводород и ставили реакцию Фогес-Проскауера. Проводили серологическую идентификацию с помощью специфических сывороток.

При определении патогенности изучаемых культур ставили биопробу на подопытных сеголетках и годовиках карпов при интраперитониальном введении суспензии высоковирулентных культур цитробактерий.

При изучении влияния на виды рыб температуры и способа заражения высоковирулентными культурами С. freundii, было использовано 154 экземпляра подопытных сеголетков карпов, содержащихся при 3 температурных экспозициях (+5оС +7оС, +15оС +17оС, +20оС +25оС). Помимо подопытных рыб при экспериментальном заражении цитробактериями интраперитониальным путем было использовано 72 белые мыши.

Отбор проб образцов мышечной ткани, внутренностей от пораженных и здоровых рыб осуществляли в соответствии с ГОСТ 24-896-81, а также ГОСТ 76-31-85. Отбор проб для микробиологических исследований проводили в соответствии с ГОСТ 26-669-85.

Гистологические исследования проводили по общепринятой методике, срезы окрашивали гематоксилин-эозином, а с целью наилучшей индикации С. freundii – по модифицированному способу Боголепова.


Микологическое исследование на наличие грибов рода Саndida.

Материал для микологического исследования брали от рыб только в тех рыбоводных хозяйствах, которые являлись стационарно неблагополучными по кандидамикозу – Новомарьевском (СХП «Волна»), Благодатненском (колхоз «Зеркальные пруды»), Невинномысском (СХП «Невинномысский) и 2 естественных водоемах (Новомарьевский лиман и Сенгилеевском водохранилище). Пробы, подлежащие исследованию, отбирали лишь от тех рыб, которые имели ясно выраженные клинические признаки и морфологические изменения, свойственные для изучаемого заболевания. К таким признакам относили темное окрашивание передней части тела, образование белых пятен на голове, глазном яблоке, изъязвление кожи в области головы, а иногда боков, брюшная водянка и некроз жаберных лепестков и концевых участков отдельных плавников. Исследование пораженных рыб на наличие дрожжеподобных грибов, проводили в соответствии с рекомендациями, приводимыми в руководствах П.Н.Кашкина (1956), Н.П.Елинова (1964), Р.Н.Ребровой (1978) и другими исследователями. Первичные посевы материала проводили на среды Сабуро, которые выдерживали в термостате до 2-3 суток и более при температуре +25оС +26оС. Затем изучали тип выросших колоний и после отбора 2-3 наиболее типичных колоний, присущих грибам рода Саndida и просмотра мазков, окрашенных 1%-ным водным раствором генцианвиолета или 1%-ным раствором основного фуксина, проводили дальнейшее выделение чистых культур кандид на средах Сабуро, сусло-бульоне и сусло-агаре. Также осуществляли изучение ферментативных свойств на 5 углеводах (глюкозе, сахарозе, лактозе, мальтозе и галактозе). Изучали характер роста кандид на средах Пагано-Левина-Трейо, агаре Литмана, Никерсона. Гемолитическую активность выявляли при росте грибов Саndida на кровяном агаре. Выявление хламидоспор и псевдомицелия проводили путем посева грибов в толщу кукурузного агара с использованием двух температурных экспозиций (+25оС, +37оС), а типа филаментации – на картофельном агаре.

При экспериментальном заражении использовали 199 сеголетков карпов, с введением высоковирулентных культур грибов С. аlbicans и C. guilliermondii, c cодержанием рыбы при температурных экспозициях +20оС +25оС. При определении патогенности выделенных культур грибов их вводили 72 белым мышам интраперитониальным способом. Наблюдения за подопытными рыбами и белыми мышами проводили в течение 1 месяца.

Изучение и идентификацию грибов рода Саndida проводили в соответствии с наставлением Департамента ветеринарии МСХ РФ от 14.07.03 г., № 13-5-02/СВ-27.

Гистологическе исследования проводили по общепринятой методике, срезы окрашивали гематоксилин-эозином, а с целью выявления грибов – по методу Шиффа.

Качественная и санитарная оценка рыбных продуктов, обсемененных C. freundii и C. albicans.

При изучении товароведческих и качественных показателей тушек рыб при указанных заболеваниях разделяли на 2 группы: доброкачественную и злокачественную рыбную продукцию. К доброкачественной рыбной продукции относили рыбу, имеющую на поверхности тела отдельные очаги геморрагического поражения или единичные изъязвления, а к злокачественной – при наличии брюшной водянки или множественных язв на поверхности тела а также при наличии снижения консистенции (дряблости) мышечной ткани, при диффузном поражении жабр. Во всех группах рыб, в каждой из которых находилось по 3-4 тушки, определялась живая масса, морфологический состав съедобных и несъедобных частей. Морфологический состав определяли путем взвешивания каждого экземпляра рыбы, после чего проводили разделение каждой тушки на съедобную и несъедобные части, а мышечную ткань, снятую с одной или двух половинок тушек, использовали для определения химического и аминокислотного состава. Химический состав рыбных продуктов (содержание воды, белка, жира и золы) определяли по общепринятым методикам: белок – по способу Кьельдаля, жир – по Сокслету, золу и влагу – методом высушивания, калорийность расчетным способом. Аминокислотный состав изучали методом хроматографии с помощью аминоанализатора «Хитачи». Идентификацию аминокислот проводили путем сравнивания характеристики удерживания аминокислот исследуемой пробы и достоверных аминокислот стандартной смеси.

Устойчивость C. freundii, патогенных форм дрожжеподобных грибов рода Саndida (C. albicans, С. guilliermondii) определяли при различных способах технологической обработки рыбных продуктов: тепловой и холодильной обработке, посоле и мариновании. Это осуществляли путем введения суспензий указанных бактерий и грибов в толщу кусков рыбы в количестве 1-1,5 млрд микробных тел на мл с последующим воздействием избранных физических и химических факторов с рекомендуемыми режимами их применения. При тепловой обработке рыбных продуктов использовались температуры +60оС, +70оС, +85оС, +100оС, в зависимости от их технологического назначения. При охлаждении тушек рыб применялись температуры, близкие к 0оС -1оС, замораживании -25оС -30оС. При посоле – обработка ее при различных способах посола: слабом – 3-7%-ном содержании поваренной соли, среднем – 10-12%-ной концентрации и 16-17%-ном содержании соли.

Результаты экспериментальных исследований обрабатывали с применением методов вариационной статистики по Стьюденту (А.Т. Усович, П. Лебедев), а аминокислотный состав обсчитывали с применением двустороннего критерия Стьюдента в программе Primer of Biostatics 4.03 для Windows-95, на IBM-совместимом компьютере. Достоверным считали различия по критерию Стьюдента при р<0,05.

  1   2   3


База данных защищена авторским правом ©zubstom.ru 2015
обратиться к администрации

    Главная страница