Республики казахстан



страница3/11
Дата25.08.2015
Размер2,21 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

УСТОЙЧИВОСТЬ ВИРУСОВ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ.

ДЕЙСТВИЕ НА ВИРУСОВ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ

ФАКТОРОВ

Действие физических и химических факторов.

Экспериментальные исследования влияния температуры на тяжесть инфекционных заболеваний восходят к Пастеру (1878), который обнаружил, что куры теряли устойчивость к сибирской язве при понижении температуры тела. Львов (1959) привлек внимание вирусологов к проблеме влияния температуры на размножение вирусов в культуре клеток и на их поведение в организме экспериментальных животных, но он чрезмерно упростил ситуацию на клеточном уровне и особенно на уровне организма (Беннетт и Никастри, 1960). Действие низких температур на организм животного приводит, например, к повышению активности щитовидной железы, к усилению стрессовой реакции, повышает метаболизм в печени и ее чувствительность к химическим поражениям, влияет на столь различные физиологические процессы, как кровообращение в конечностях, иммунный ответ и воспалительную реакцию. Действие высоких температур вызывает столь же разнообразные физиологические реакции.

Львов подтвердил наблюдение Дьюбса и Виннера (1957) о том, что поливирус, культивированный в клетках при низкой температуре, утрачивает способность размножаться при 37°С; методом серийных пассажей удалось осуществить отбор температурочувствительных и температуроустойчивых штаммов. Он показал наличие связи между устойчивостью к температуре и нейровирулентностью полиовируса (Львов и др., 1959). Аттенуированные штаммы всегда плохо растут при высоких температурах, и культивирование при низких температурах оказалось полезным методом отбора и выращивания вакцинных штаммов. Наличие такого соотношения было установлено и для вируса энцефаломиокардита мышей (Пероль-Ваучес, 1961). Было показано, что аттенуированные (температурочувствительные) штаммы более вирулентны для мышей, у которых искусственно понижали температуру тела, и менее вирулентны для мышей с повышенной температурой (по сравнению с мышами, содержащимися при нормальной температуре окружающей среды).

Самые ранние наблюдения, касающиеся влияния температуры окружающей среды на вирусные заболевания, были сделаны в отношении вируса миксомы (Томпсон, 1938; Паркер и Томпсон, 1942). Было показано, что поддержание высокой температуры в помещении, при которой внутренняя температура тела кроликов повышалась с 39 до 40°С, а их кожная температура с 33-36 до 38-40°С, спасало их от гибели при заражении вирулентным вирусом миксомы, неизменно летальном в обычных условиях. Маршал (1959) подтвердил это и показал, что при использовании аттенуированного штамма вируса миксомы низкая температура среды резко повышала тяжесть заболевания и смертность. Определение уровня виремии и интенсивности образования антител у кроликов, содержавшихся при высоких температурах, выявило, что оба эти показателя изменялись таким образом, что при низкой температуре заболевание протекало тяжелее, а при высокой - легче.

Другие опыты проводились на мышах и собаках. Робертс (1964) показал, что мыши приблизительно в 100 раз чувствительнее к вирусу эктромелии, если их содержать при 2°С, чем если их содержать при 20°С. При низкой температуре интенсивность обмена у мышей была повышена, что совпадало с более тяжелым поражением печени без усиленного размножения вируса в этом органе. Новорожденные щенки высокочувствительны к генерализованным инфекциям, вызываемым герпесвирусами собак; в возрасте 4-8 недель развивается устойчивость к этим инфекциям. Содержание зараженных новорожденных щенят при высокой температуре и понижение температуры тела 4-8 недельных собак в обеих случаях меняло ситуацию на обратную. Был сделан вывод о том, что высокая чувствительность новорожденных щенят к диссеминированной инфекции вирусом герпеса отчасти связана с низкой температурой их тела и недоразвитием механизмов теплорегуляции (Кармайкел, 1969).

Большая часть экспериментальных работ в этой области касается влияния температуры окружающей среды. Однако почти все тяжелые вирусные инфекции у высших млекопитающих сопровождаются лихорадочным состоянием (38-41 °С), развивающимся обычно к концу инкубационного периода, когда размножение вируса уже в основном закончено и образовались пирогенные комплексы антиген-антитело (Рут и Вольф, 1968). Все антивирусные механизмы, обусловленные высокой температурой, действуют во время лихорадочного состояния, но нет никаких сведений о том, в какой степени это состояние обуславливает прекращение размножения вируса. Львов (1959, 1969) постулировал, что лихорадочное состояние представляет собой природный механизм защиты против вирусов и что вирулентные мутанты, способны размножаться в организме животных при повышенной температуре тела, возникли в результате естественного отбора. Логично признать температурочувствительные мутанты кандидатами на роль живых вирусных вакцин при ряде вирусных заболеваний.

Известна одна ситуация, при которой повышенная температура тела стимулирует размножение вируса, а именно рецидивирующий простой герпес у человека (так называемая «лихорадка»).

Таким образом, в разных ситуациях повышение температуры тела (или отдельных частей тела) может подавлять размножение вируса либо прямо- путем воздействия на какой-либо этап этого процесса, либо косвенно- посредством увеличения эффективности защитных реакций организма, в частности образования антител и интерферона. Понижение температуры тела дает обычно обратный эффект и, кроме того, может повысить чувствительность органов-мишеней к повреждающему действию вируса



Стресс - это термин весьма общего характера, которым описывают разнообразные, преимущественно внешние воздействия, вызывающие в организме в известной мере однотипные изменения; так, животное может подвергаться алиментарному, тепловому, психологическому, инфекционному и другим типам стресса. В соответствующей адаптивной реакции организма на стресс участвуют гипофизарноадреналовая система (кортикостероидные гормоны) и автономная нервная система (адреналин). Ясно поэтому, что различные типы стресса оказывают влияние на вирусную инфекцию, стимулируя секрецию кортикостероидов.

Самый эффективный вид деконтаминации - стерилизация высокой температурой. Приборы для автоклавирования горячим паром под давлением и сухим жаром при 160°С и выше составляют основное стерилизационное оборудование всех лабораторий, работающих с возбудителями инфекционных болезней. Ультрафиолетовый свет удобен для деконтаминации воздуха и инфицированных поверхностей, однако его применение несколько ограничивается из-за неспособности проникать в глубь стерилизуемого объекта. Защитные боксы должны быть оборудованы ультрафиолетовыми лампами. Эффективность ультрафиолетового облучения определяется его продолжительностью и интенсивностью света. Чувствительность вирусов к ультрафиолетовому и рентгеновскому облучению зависит преимущественно от размеров их генома. Поэтому, например, вирус осповакцины (мол. масса нуклеиновой кислоты около 2 10) инактивируется при рентгеновском облучении в дозе около 5 104 рад, в то время как для инактивации мелкого вируса папиломы (мол.масса генома 3 106) требуется доза 4 105 рад. Метод сублимационного высушивания (замораживания- высушивания), сочетающий в себе два способа - замораживание и сушку в вакууме - наиболее современный и перспективный способ консервирования вируссодержащего материала. Он обеспечивает стандартность товарного вида препаратов и длительное сохранение их биологической активности.

Аденовирусы крупного рогатого скота довольно устойчивы к физико-химическим воздействиям, трипсину, эфиру, хлороформу, сапонину, дезоксихолату натрия и 50%-ному этиловому спирту. Абсолютный этиловый спирт и формалин в конечной концентрации 0,10,3% инактивируют вирус. Обработка хлороформом повышает инфекционный титр вируса на 0,5lg. Вирусы инактивируются при температуре 56°С за 30-60 мин. Аденовирусы устойчивы к изменению рН среды от 3 до 9 в течение 3 ч при комнатной температуре, полностью инактивируются УФ-лучами за 30-60 минут. Длительно хранятся при минус 30°С, при 4°С- более 6 месяцев, при комнатной температуре -1-4 месяцев и при 36°С- 15-60 дней. Устойчивы к повторному

замораживанию и оттаиванию, хорошо сохраняются при рН 6-9 и переносят сушку.



Хранение и консервация вирусов. Штаммы вирусов хранят в холодильнике под замком с пломбой или печатью. Выделенные изоляты, как и штаммы стандартных вирусов, необходимые для сравнения и серологических исследований, следует хранить в условиях, обеспечивающих им максимально длительную жизнеспособность. При рН среды 7,0-7,4 и внесении в нее определенных добавок вирус можно хранить при 4° в течение нескольких недель, а некоторые виды в течение года без потери инфекционных свойств.

Многие вещества обладают консервирующим или защитным свойством по отношению к вирусам. Чаще всего используют глицерин, который обладает бактериостатическим действием, но в то же время и защищает вирусы. Его применяют в качестве добавок к вируссодержащему материалу в количестве 10-40%. Довольно широко применяется также фенол, который в концентрации 0,2-0,5% большинство вирусов не инактивирует (например, вирусы чумы свиней, болезни Ауески, ящура). Для консервирования вирусов можно использовать 5-20%-ный раствор NaCI, 10%-ный раствор глицерина, 0,15 M раствор KCI. Стабильность вирусов значительно увеличивается в результате добавления 1-10% глюкозы, сахарозы или мальтозы, 10-50% сыворотки или сывороточного альбумина, 10-50% обезжиренного молока, 0,1-2,0% желатина. Чем меньше белка в вируссодержащей взвеси, тем меньше его стабильность. Поэтому очищенные вирусы быстро теряют свою биологическую активность.

При хранении вирусов целесообразно также использовать полимеры: 0,5-3%-ную метилцеллюлозу или 0,1-2%-ный

поливиниловый спирт. Хорошим стабилизирующим действием на некоторые вирусы обладает 5%-ный ДМСО (диметилсульфоксид), проявляющий при этом и антибактериальные свойства. Вирусы в культуральной жидкости стабилизируются компонентами питательной среды (сыворотка, гидролизат и др.).

Таким образом, большинство вирусов можно сохранять при температуре 4°С в течение нескольких недель и даже нескольких лет при условии добавления указанных выше компонентов-стабилизаторов. Однако известно, чем ниже температуры замораживания вируса, тем дольше сохраняется его жизнеспособность. При быстром замораживании небольших количества вируса до минус 190°С с последующим хранением при этой температуре практически не снижается титр вируса. Такая температура, однако, очень редко используется в диагностической работе. В лабораториях хорошие результаты дает сохранение вирусов при температуре минус 70°С.

Использование стабилизирующих веществ необходимо не только при хранении вируса, но и для предотвращения потерь его в процессе самого замораживания, особенно вируссодержащих образцов экстраэмбриональной и культуральной жидкости. Если же в культуральной питательной среде содержится 2-19% сыворотки или гидролизата лактальбумина, то ее можно заморозить без добавления стабилизирующих веществ. Хорошее защитное действие при замораживании вирусов и хранении их в таком состоянии оказывает добавление к вируссодержащему материалу одного из таких компонентов, как 10-30% сыворотки крови, инактивированной при 56- 60°С; 0,5-1,5% желатина; 20-50% обезжиренного молока; 0,1-0,5% метилцеллюлозы; 1-5% пептона; 5-20% гидролизата животного белка и 10% ДМСО. Последний, хорошо защищает вирусы, имеющие оболочку, особенно вирусы герпеса, кори, везикулярного стоматита. Даже при четырехкратном оттаивании и замораживании установлено его эффективное защитное действие.

В условиях от минус 20° до минус 30°С можно хранить длительное время все безоболочечные вирусы, а также поксвирусы. В то время вирусы, имеющие липидную оболочку, лучше сохранять при температуре от минус 60° до минус 80°С (особенно это касается герпес-, тога-, корона- и миксовирусов). Хранение при температуре от минус 20° до минус 30°С вызывает снижение их титра, несмотря на добавление консервирующих и защитных веществ. Если температура хранения вирусов минус 25°С, их титр необходимо проверять 2 раза в год, при температуре минус 30°С и ниже - 1 раз в год.

Контрольные вопросы: 1 Влияние физических и химических факторов на вирусы. 2 Хранение и консервация вирусов. 3. Какие вещества обладают консервирующими или защитными свойствами? 4 Оптимальные температуры для длительного хранения вируссодержащих материалов.

ГЕНЕТИКА И ЭКОЛОГИЯ ВИРУСОВ



Наследственная изменчивость вирусов. У вирусов роль хромосом выполняет нить нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), у одних она цельная, у других (грипп, рео-, аренавирусы)- фрагментированная. Отдельные участки нуклеиновой кислоты, ответственные (детерминирующие) синтез определенного полипептида, получили название генов.

Фенотип - это совокупность всех внешних и внутренних признаков и функции данного вируса. Фенотипические свойства вируса могут быть установлены морфологическим и серологическими методами. Генотип определяется только структурой наследственного материала-ДНК или РНК, т.е. последовательностью нуклеотидов в их молекулах. Фенотип вируса не является его постоянным свойством, он может изменяться как в результате его мутаций, так и под влиянием внешних условий репродукции. Генотип - это постоянное свойство вируса, и меняется он в результате мутаций, происходящих в геноме.

Число генов у вирусов значительно варьирует: простейшие из известных вирусов содержат от 3 до 5 генов (например, ДНК- содержащий вирус полиомы); у пикорнавирусов 6-8 генов. Однако у более сложного вируса (например, крупного бактериофага Т4) более 30 генов контролируют синтез белков оболочки и не менее 15- синтез нуклеотидных предшественников; для размножения этого фага требуется участие примерно сотни генов. Геном вирусов животных является гаплоидным, за исключением ретровирусов, которые имеют диплоидный геном, представленный двумя идентичными молекулами РНК. У вирусов с фрагментированным геномом (вирусы гриппа, реовирусы) каждый фрагмент обычно представляет собой один ген. В составе генов ДНК-содержащих вирусов есть регуляторные участки, в том числе промотор, контролирующие функцию структурных генов. Сильными промоторами являются концы многих вирусных ДНК, представляющие собой длинные концевые повторы.

У многих вирусов молекулярная масса синтезирующихся белков превышает теоретически рассчитанную. Этот феномен объясняется наличием у вирусов механизмов, позволяющих получить развернутую генетическую информацию при максимальной экономии генетического материала. Способами увеличения генетической информации являются:


  1. двукратное считывание одной и той же и-РНК, но с другого инициирующего кодона; 2) сдвиг рамки трансляции; 3) сплайсинг- процесс вырезания интронов и сшивания экзонов; 4) транскрипция с перекрывающихся областей ДНК и др.

В составе и-РНК обычно встречается несколько инициирующих кодонов. Трансляция может происходить без сдвига рамки и со сдвигом ее. Генетический код является триплетным, это означает, что три нуклеотида, составляющих триплет, или кодон, кодируют одну аминокислоту. В том случае, если триплеты сохранены и генетический код не изменился, при трансляции с двух разных инициирующих кодонов будут синтезироваться полипептиды, представляющие собой укороченный участок первого полипептида.

Сплайсинг со сдвигом рамки широко распространен у ряда вирусов (вирусы гриппа, парамиксо-, бунья-, аденовирусы и др.). Одним из способов экономии генетического материала является нарезание полипептида-предшественника на участки разной длины, в результате чего образуются разные полипептиды с перекрывающимися аминокислотными последовательностями. Подобный механизм нарезания имеет место у аденоассоциированных вирусов.



Таким образом, общее число триплетов в составе молекулы нуклеиновой кислоты может быть меньше суммы числа триплетов, входящих в состав всех генов. Более точные представления о числе генов, можно получить путем биохимического и генетического анализов. В результате перекрывания генов и сдвига рамки трансляции «размыкаются» границы генов, и понятие «ген» в известном смысле утрачивает первоначальное значение как дискретный фрагмент генома и приобретает скорее функциональное значение.

Мутация у вирусов. В основе наследственного изменения свойств вирусов, могут лежать два процесса: 1) мутация, т.е. изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома вируса, ведущее к фенотипический выраженному изменению свойства, и

  1. рекомбинация, т.е. обмен генетическим материалом между двумя близкими, но отличающимися по наследственным свойствам вирусами. Мутация- изменчивость, связанная с изменением самих генов. Она может иметь прерывистый, скачкообразный характер и приводит к стойким изменениям наследственных свойств вирусов. Все мутации вирусов делятся на две группы: спонтанные и индуцированные; по протяженности их делят на точечные и аберрационные (изменения, затрагивающие значительный участок генома). Точечные мутации обусловлены заменой одного нуклеотида (для РНК-содержащих вирусов) или одной пары комплементарных нуклеотидов (для ДНК- содержащих вирусов).

Аберрации у фагов обусловлены делециями (выпадением) различного числа нуклеотидов, от одной пары до последовательности, которая обуславливает (детерминирует) одну или несколько функций вируса. Как спонтанные, так и индуцированные мутации делят на прямые и обратные (реверсии). Мутации могут иметь разные последствия. В одних случаях они ведут к изменениям фенотипических проявлений в нормальных условиях. В других случаях мутации является летальной, так как вследствие ее нарушается синтез или функция жизненно важного вирусоспецифического белка, например вирусной полимеразы. В некоторых случаях мутации являются условно летальными, так как вирусоспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него условиях и теряет эту способность в неразрешающих условиях. В живой природе мутации возникают чрезвычайно редко и спонтанно, т.е. под влиянием причин, трудно устанавливаемых в каждом отдельном случае. Спонтанные мутации, возникающие в одном и том же гене, распределяются по его длине неравномерно. Одни участки гена мутируют часто, их называют «горячими» точками, другие- редко.

Мутации при пассажах на животных. Примеров получения стабильных высокоиммунных штаммов вирусов методом длительной адаптации к лабораторным, естественно восприимчивым или невосприимчивым животным много. Многократные пассажи вируса желтой лихорадки через мозг мышей, привели к значительному усилению его нейротропных свойств для мышей и утрате патогенности для обезьян. При адаптации вирусов к естественно восприимчивым видам животных или к гетерогенным тканям экспериментальновосприимчивых животных решающее значение в успехе работы имеют вид и возраст животного, способ введения вируса и его свойства. Наследственная изменчивость вирусов наблюдалась и при пассировании их на куриных эмбрионах. Так были получены вакцинные штаммы для профилактики инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита и т.д. В культурах клеток и тканей успешно выращиваются и аттенуируются многие вирусы. Так, после длительного пассирования в культуре переживающей ткани куриных эмбрионов вирус желтой лихорадки утратил нейротропные и висцеротропные свойства, сохранив иммуногенность. В основе механизма наследственной изменчивости вирусной популяции при пассажах лежат два процесса- мутация и селекция, причем и в том и другом процессе важную роль играет внешняя среда, являющаяся одновременно индуктором мутации и селективным фактором.

При взаимодействии геномов могут наблюдаться такие формы генетических воздействий, как множественная реактивация, рекомбинация, пересортировка генов, кросс-реактивация, гетерозиготность. Возможен обмен как полными генами (межгенная рекомбинация), так и участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация). Рекомбинации вирусов позвоночных удается получить только при скрещивании близких по свойствам вирусов, принадлежащих к одному роду. В экспериментальных условиях гибридные формы можно получить, одним из четырех способов: 1) при совместном культивировании двух жизнеспособных вирусов, при введении их в организм или культуру клеток одновременно или в разное время; 2) если в чувствительную систему вводят живой и инактивированный вирус; 3) при совместном культивировании вируса и вирусной нуклеиновой кислоты, выделенной из другого штамма; 4) в случаях одновременного введения в культуру клеток разных нуклеиновых кислот, соответствующих двум разновидностям вирусов. Различают три вида рекомбинации: 1) общая рекомбинация, которая происходит между гомологичными последовательностями. Например, между геномами разных серотипов одного и того же вируса. 2) Сайтспецифическая рекомбинация, которая происходит между молекулами нуклеиновых кислот, имеющих ограниченное структурное сходство, т.е. имеющими гомологичные последовательности только на коротких участках молекулы. 3) Незаконная рекомбинация, которая происходит между молекулами, не имеющими каких-либо сходных последовательностей нуклеотидов. Например, между геномами иридо- и поквирусов. Вариантом рекромбинации является феномен, получивший название пересортировки генов. Она наблюдается при генетических взаимодействиях между вирусами, имеющими сегментированный геном. Чаще всего это происходит с вирусами гриппа А (утка, человек).



Гетерозиготностъ - феномен, заключающийся в том, что при одновременной репродукции в клетке, нескольких частиц вирусов, различающихся по наследственным свойствам, могут образовываться вирионы, содержащие полный геном одного родительского штамма и, кроме того, часть генома (или полный геном) другого вируса (диплоидные или полиплоидные вирионы). Хотя такого рода объединение генетического материала в одной вирусной частице не наследуется, оно позволяет такому вириону дать потомство, в котором будет содержаться часть вирусных частиц со свойствами одного, а часть

  • другого родителя.

Транскапсидация - это феномен, при котором часть чужеродного генетического материала, заключенного внутри капсида другого неродственного вируса, способна переноситься в стабильной форме в чувствительные к основному вирусу клетки. Этот феномен наблюдается при одновременном выращивании в клетках аденовируса и обезьяньего вируса SV40.

Кросс-реактивация (спасение маркера). Одним термином обозначались два разных явления: реактивация инактивированного генома не инактивированным и взаимная реактивация двух инактивированных геномов. Второе явление лишь условно отличается от множественной реактивации.

Все признаки вирусов, информация о которых закодирована в генах, называются генетическими. Как и все организмы, вирусы подтверждены изменчивости, более того, изменчивость у них выражена в гораздо большей степени. Совокупность всей наследственной информации вируса определяет его генотип. Под фенотипом вируса понимают совокупность всех проявляемых в конкретных условиях генетических признаков. При получении генетически однородной популяции в экспериментальных исследованиях используются следующие методы селекции: 1) выделение клонов из одиночных пустул на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона; 2) селекция клонов из бляшек на культуре клеток; 3) селекция методом предельных разведений; 4) селекция методом избирательной адсорбции и элюции; 5) селекция методом пассажей в измененных условиях культивирования.



Генная инженерия. Если раньше биотехнология была полем деятельности преимущественно микробиологов и энзимологов, то сегодня благодаря достижениям вирусологии, бактериологии и молекулярной генетики (особенно открытию способов модификации ДНК и переноса ее из одних организмов в другие) она стала одним из приоритетных направлений научно-технического прогресса. Современные задачи биотехнологии поистине всеобъемлющи. Прежде всего, имеются в виду следующие направления исследований и разработок: 1) производство продуктов питания.; 2) повышение

продуктивности сельскохозяйственных культур (клонирование и отбор разновидностей растений на основе тканевых культур); 3) биологическая промышленность (производство безопасных и недорогих противобактерийных и противовирусных вакцин, биосинтез антибиотиков, гормонов и интерферонов) и 4) уменьшение заражения окружающей среды (очистка сточных вод, переработка отходов и побочных продуктов сельского хозяйства и промышленности).

Генная инженерия изучает закономерности конструирования in vitro рекомбинантных молекул ДНК и поведение их в реципиентной клетке. Цель этого научного направления - создание новых генетических структур. Хотя успехи генной инженерии еще скромны, однако перспективы ее поразительны. Существо генно-инженерных манипуляций сводится к триаде: ферменты, гены и векторы. Получение рекомбинантных молекул складывается из четырех этапов: 1) получение автономно реплицирующегося вектора; 2) конструирование рекомбинантной молекулы ДНК; 3) клонирование-введение гибридной молекулы ДНК в реципиентные клетки, селекция и клонирование клеток, содержащих гибридные молекулы ДНК; 4) отработка биотехнологии получения нужного белка, закодированного в гибридных молекулах ДНК.

Контрольные вопросы: 1 Наследственная изменчивость вирусов. 2 Способы увеличения генетической информации. 3 Виды мутации вирусов. 4 Что изучает генная инженерия?

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11


База данных защищена авторским правом ©zubstom.ru 2015
обратиться к администрации

    Главная страница