Диссертация на соискание ученой степени



страница1/9
Дата26.08.2015
Размер1,62 Mb.
  1   2   3   4   5   6   7   8   9

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Нижегородская государственная медицинская академия»



Министерства здравоохранения Российской Федерации

 


На правах рукописи

Лукова Ольга Алексеевна


Факторы и условия, регулирующие функциональную активность буккальных эпителиоцитов и их взаимодействие с Candida albicans

03.03.01 физиология

03.02.03 микробиология

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

Заславская М. И.


Нижний Новгород

2015
О Г Л А В Л Е Н И Е



ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………….…………

6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………….…………………..


12





1.1. Функциональная активность эпителиоцитов слизистых оболочек………………………………………………………….......

12





1.2. Адгезивные взаимодействия мукозальных эпителицитов с микроорганизмами………………………………………………………...

14





1.3. Толл - подобные рецепторы эпителиоцитов слизистых оболочек

16




1.4. Внутриклеточные сигнальные пути эпителиоцитов……………...

19




1.5. Факторы, способные влиять на функциональную активность эпителиоцитов …………………...…………………………………..

22








1.5.1. Гормоны……………………………………………………….

22







1.5.2. Цитокины……………………………………………………...

25







1.5.3. Иммуномодуляторы………………………………………….

27







1.5.4. Микробные метаболиты……………………………………...

32




1.6. Эпителиоциты слизистых оболочек в клинико-лабораторных исследованиях…………………………………………............................

33


Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………..


35





2.1. Объем исследований ………………………………………………..

35




2.2. Получение эпителиоцитов слизистых оболочек…………………..

35




2.3. Оценка естественной колонизации эпителиоцитов……………….

35




2.4. Получение клеточной суспензии Candida аlbicans ………………...

36




2.5. Оценка адгезии в системе «эпителиоциты – C.albicans»………….

36




2.6. Приготовление факторов для воздействия на эпителиоциты…….

37







2.6.1. Получение продуктов метаболизма микроорганизмов….....

37






2.6.2. Женские половые гормоны………………………………….


37







2.6.3. Цитокины……………………………………………………..

38







2.6.4. Иммуномодулирующие препараты………………………….

38







2.6.5. Антисептические средства…………………………………..

38




2.7. Определение уровня экспрессии Toll-подобных рецепторов на буккальных эпителиоцитах и жизнеспоспособности клеток …..

38





2.8. Ингибирование внутриклеточных сигнальных путей …………….

41







2.8.1. Подавление активации транскрипционного фактора

NF-kB …………………………..…..…………………………



41







2.8.2. Ингибирование активности внутриклеточных митоген-активированных киназ ERK1/p38…………………………..

41




2.9. Получение сыворотки человека…………………………………….

42




2.10. Определение уровня сывороточных иммуноглобулинов IgE и IgG……………………………………………………………………

42





2.11. Определение уровня растворимых sCAM – I в сыворотке……

42




2.12. Схема применения лизоцим-содержащего антисептического

препарата у часто болеющих детей……………………………..


42





2.13. Схема лечения больных с онихомикозом и микробной экземой с использованием иммуномодулирующих препаратов…………

43





2.14. Статистическая обработка результатов…………………………...

44

Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ………………………………...



45





3.1. Влияние эндогенных и экзогенных факторов на адгезивность эпителиоцитов слизистых оболочек в экспериментальной системе с C. albicans in vitro………………………………………..

45








3.1.1. Влияние женских половых гормонов на адгезивность эпителиоцитов в системах с C. albicans………………………

3.1.2. Влияние цитокинов на адгезивность эпителиоцитов в системах с C. albicans………………………………………


46
52






3.1.3. Влияние иммуномодуляторов на адгезивность эпителиоцитов в системах с C.albicans……………............

55








3.1.4. Влияние антисептических препаратов на адгезивные реакции мукозальных эпителиоцитов в системах с C. albicans …………………………………………………...

59





3.1.5. Влияние микробных метаболитов на адгезивность эпителиоцитов в системах с C. albicans………………….

60





3.2. Участие внутренних метаболических путей в регуляции адгезивных реакций буккальных эпителиоциов……………….

63





3.3. Условия и факторы, регулирующие экспрессию TLR-2 и TLR-4

на буккальных эпителиоцитах……………………………………...


65








3.3.1. Влияние половых гормонов на экспрессию toll-подобных рецепторов буккальными эпителиоцитами in vitro………

66








3.3.2. Влияние цитокинов на экспрессию toll- подобных рецепторов буккальными эпителиоцитами in vitro…….....

69








3.3.3. Влияние иммуномодулирующих препаратов на экспрессию toll- подобных рецепторов буккальных эпителиоцитов здоровых доноров in vitro ............................

3.3.4. Влияние иммуномодулирующих препаратов на экспрессию toll- подобных рецепторов буккальных эпителиоцитов у пациентов с заболеваниями пародонта…



72

75









3.3.5. Влияние антисептических препаратов на экспрессию toll- подобных рецепторов буккальными эпителиоцитами in vitro………………………………………………………….

81








3.3.6. Влияние микробных метаболитов на экспрессию toll- подобных рецепторов буккальными эителиоцитами...........

83





3.4. Естественная колонизация буккальных эпителиоцитов в оценке эффективности применения иммуномодуляторов и антисептиков при некоторых хронических патологиях ………..

88








3.4.1. Естественная колонизация буккального эпителия больных с микробной экземой до и после лечения с использованием препарата «Полиоксидоний»…………….

89








3.4.2. Естественная колонизация буккального эпителия взрослых с онихомикозом дрожжевого генеза до и после лечения с использованием препарата «Деринат»…………

92








3.4.3. Естественная колонизация буккального эпителия у часто болеющих детей до и после применения лизоцим - содержащего препарата……………………………………...

94


ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………

97

ВЫВОДЫ…………………………………………………………………...............

110

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………............

112




Список сокращений

ДМСО

-

диметилсульфоксид

ЗФР

-

забуференный физиологический раствор (рН 7,2-7,4)

ЛГ

-

лютеинизирующий гормон

ОРЗ

-

острое респираторное заболевание

ФСГ

-

фолликулостимулирующий гормон

ХГЧ

-

хорионический гонадотропин

ЧБД

-

часто болеющие дети

CD

-

маркёры клеточной дифференцировки (cluster of differentiation)

sICAM-I

-

растворимые молекулы межклеточной адгезии I

IFN

-

интерферон (interferon)

IL

-

интерлейкин (interleukin)

NF-kB -

-

нуклеарный фактор kB

NK

-

естественный киллер (natural killer)

PAMPs

-

патоген-ассоциированные паттерны и молекулярные образы

микроорганизмов



TLR

-

толл-подобные рецепторы (toll-like receptor)

TNFα

-

Фактор некроза опухоли α (tumor necrosis factor)

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время большое внимание уделяется поиску простых и неинвазивных методов выявления патологических изменений в организме человека. Одним из таких перспективных направлений является исследование функционального состояния эпителиоцитов слизистых оболочек, которое может служить источником важной диагностической и прогностической информации [Маянский А.Н. и соавт. 2004; Полякова В.О. и соавт., 2015)].

Функциональная активность мукозальных клеток находит отражение в процессах клеточной дифференцировки, синтезе различных молекул, экспрессии рецепторов и отражает состояние местного и общего гомеостаза организма человека, а также его нарушения при патологии и старении [Маянский А.Н и соавт., 2004; Пальцев М.А.и соавт., 2012; Полякова В.О. и соавт., 2015]. Изменение функционального состояния эпителиоцитов является следствием различных воздействий на рецепторный аппарат клетки. Так, благодаря способности экспрессировать toll-подобные рецепторы (TLRs), эпителиальные клетки могут обнаруживать типовые молекулярные последовательности-паттерны (PAMPs) микробного или иного происхождения, не свойственные тканям человека [Полторак, А.Н., 2014; Brightbill H., Modlin R. 2000; Zhang G.,2001; Cario E.,2002; Akira S., Hemmi H., 2003; Takeda K., Akira S., 2005; Weindl, G. et all, 2007. Naglik, J.R., Moyes D., 2011а; McClure R., Massari P., 2014].

TLRs являются мощными активаторами внутриклеточных сигнальных путей, таких как система нуклеарного фактора kB и МАР-киназ, которые способствуют синтезу функционально активных молекул (цитокины, молекулы межклеточной адгезии, рецепторы, белки острой фазы, ферменты, молекулы главного комплекса гистосовместимости и др.) мукозальными клетками [Маянский А.Н. и соавт., 2007; Baldwin A.S.Jr., 1996; Barnes P.J. et all., 1997; Andreakos E. et.all. 2005; Weindl, G. et all, 2010; Hayden M. S., Ghosh S. 2011]. Через продукцию данных медиаторов, эпителиоциты слизистых оболочек активно вовлекаются в воспалительные и иммунные реакции, транслируя сигналы лимфоцитам, макрофагам и дендритным клетками, присутствующим в lamina propria [Топтыгина А.П., Афанасьев С.С., 2009].

Для оценки функциональной активности эпителиоцитов слизистых оболочек в настоящее время используют различные методы, основанные на изучении их морфологии, выявлении клеточных маркеров и рецепторов (иммуногистохимия), продукции цитокинов, медиаторов, определении содержания ДНК (микроспектрофотометрия), а также уровня естественной колонизации нормальной микрофлорой [Банченко Г.В. и соавт. 1997; Быков В.Л.,1997; Абаджиди М.А. и соавт., 2003; Авдалян А.М. и соавт., 2003; Сапронова Е.А. и соавт, 2003; Махрова Т.В., и соавт., 2004; Маянский А.Н. и соавт.. 2005; Караулов А.В. и соавт.,2012; Бочкарева О.П. и соавт, 2013; Полякова В.О. и соавт., 2015; Steele С., Fidel P.L., 2002]. В то же время, функционирование рецепторного аппарата эпителиоцитов и его реактивность, т. е. способность отвечать на стимулы - изучены недостаточно. Также не в полной мере определен спектр экзогенных и эндогенных факторов, способных регулировать экспрессию рецепторов эпителиальных клеток, в частности, обеспечивающих адгезивные контакты с микроорганизмами.

В настоящей работе были использованы новые методические подходы для оценки функционального статуса клеток слизистых оболочек, основанные на изучении работы их рецепторного аппарата. Реактивность рецепторов эпителиоцитов оценивалась по экспрессии TLRs, а также по способности клеток к адгезивным взаимодействиям с тест-культурой Сandida albicans в процессе искусственной колонизации in vitro.



Целью работы является исследование функциональной активности рецепторного аппарата буккальных эпителиоцитов под влиянием различных факторов и условий, а также при взаимодействии с C. albicans и микробиотой полости рта.


Задачи исследования:

  1. Определить влияние эндогенных и экзогенных факторов: половых гормонов, цитокинов, иммуномодуляторов, антисептиков и микробных метаболитов - на функциональную активность рецепторного аппарата эпителиоцитов слизистых оболочек при адгезивных контактах с C. albicans.

  2. Проанализировать взаимоотношение систем нуклеарного фактора kB и митоген-активированных киназ с активностью рецепторного аппарата буккальных эпителиоцитов при адгезивных взаимодействиях с C. albicans.

  3. Оценить экспрессию TLR-2 и TLR-4 буккальными эпителиоцитами под влиянием эндогенных и экзогенных факторов, а также, при хроническом пародонтите.

  4. Сравнить уровень естественной колонизации буккального эпителия у пациентов с заболеваниями различного генеза до и после терапии с использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков.


Научная новизна

Впервые получены данные об изменении адгезивных свойств буккальных эпителиоцитов под действием эндогенных и экзогенных факторов: половых гормонов, цитокинов, иммуномодуляторов и антисептиков в системах с C. albicans in vitro.

Получены новые сведения о значении нуклеарного фактора kB для реализации контактных взаимодействий буккальных эпителиоцитов с

С. albicans.

Впервые определен уровень экспрессии TLR-2 и TLR-4 на буккальных эпителиоцитах в норме и при пародонтите методом проточной цитофлюориметрии, а также выявлены субпопуляционные изменения среди TLR-2- и TLR-4-позитивных клеток под влиянием эндогенных и экзогенных факторов.

Впервые изучена динамика изменения уровня естественной колонизации буккальных эпителиоцитов у пациентов на фоне применения комплексной терапии с использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков.

Теоретическая и практическая значимость

Подтверждена высокая чувствительность и информативность экспериментальной модели «адгезия C. albicans на эпителиоцитах слизистых оболочек in vitro» для оценки реактивности рецепторного аппарата эпителиальных клеток в ответ на различные стимулы.

Показано, что эпителиоциты разных биотопов – буккальные и вагинальные клетки – однотипно меняют адгезивную активность в отношении кандид под действием половых гормонов in vitro.

Разработан способ изучения функциональной активности и реактивности буккальных эпителиоцитов по оценке экспрессии toll-подобных рецепторов методом проточной цитофлюориметрии.

На основе метода исследования естественной колонизации буккального эпителия разработан алгоритм оценки эффективности применения иммуномодуляторов и оральных антисептиков в комплексном лечении хронических патологий.
Внедрение результатов работы

Разработанные методы и алгоритмы используются в лабораторно-диагностической и научно-исследовательской работе Нижегородского филиала ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава РФ и стоматологической поликлинике ГОУ ВПО «НижГМА Минздрава» (г. Нижний Новгород).


Положения, выносимые на защиту

Гормоны, участвующие в обеспечении овуляции и поддержании состояния беременности (лютеинизирующий гормон, прогестерон) усиливают адгезивность эпителиоцитов слизистых оболочек в отношении C. albicans in vitro.

Обработка эпителиоцитов иммуномодуляторами и оральными антисептиками in vitro снижает способность буккальных клеток адгезировать C. albicans.

Кандида-зависимая активация нуклеарного фактора kB в буккальных клетках усиливает контактное взаимодействие эпителиоцитов с C. albicans.

Экспрессия TLR-2 и TLR-4 на буккальных эпителиоцитах способна регулироваться микробными метаболитами и иммуномодуляторами, а также меняется при хроническом пародонтите.

Анализ изменения уровня естественной колонизации буккального эпителия может применяться в оценке эффективности терапевтических мероприятий с использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков у пациентов разных возрастных групп с хроническими патологиями (онихомикоз, микробная экзема, респираторные заболевания).



  1   2   3   4   5   6   7   8   9


База данных защищена авторским правом ©zubstom.ru 2015
обратиться к администрации

    Главная страница