Аутоиммунных буллезных дерматозов



страница2/6
Дата26.08.2015
Размер0,81 Mb.
1   2   3   4   5   6

Ме­тод вы­яв­ле­ния фик­си­ро­ван­ных ан­ти­тел (им­му­ног­ло­бу­ли­нов) и полных им­мун­ных ком­плек­сов. При­ме­ня­ли клас­си­че­ские ме­тоды прямой и непрямой иммунофлюоресценции [Белецкая Л.В., Данилова Т.А., 1977; Beutner E., Chorzelski T.P. et al., 1973] с ис­поль­зо­ва­ни­ем мо­но­спе­ци­фи­че­ских лю­ми­нес­ци­рую­щих сы­во­ро­ток про­тив IgG, IgA, IgM (НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Га­ма­леи АМН РФ; ИМТЕК, Москва), люминесцирующих сывороток против С4 и С3 компонентов комплемента (НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Га­ма­леи АМН РФ; CHEMICON, Австралия), моноклональных антител против C4d компонента комплемента (QUIDEL, США) и сыворотки против фибриноген/фибрин (DAKO CYTOMATION, Дания).

Се­рий­ные крио­стат­ные сре­зы по­ме­ща­ли на пред­мет­ное стек­ло, под­су­ши­ва­ли в те­че­ние 30 мин при ком­нат­ной тем­пе­ра­ту­ре. Затем срезы промывали РВS (рН 7,0-7,4) в те­че­ние 3-5 мин с це­лью уда­ле­ния не свя­зан­ных с тка­ня­ми рас­тво­ри­мых бел­ков и об­ра­ба­ты­ва­ли лю­ми­нес­ци­рую­щей сы­во­рот­кой (мет­ка изо­тио­циа­на­том флюо­рес­цеи­на) про­тив IgG, IgМ, IgА и С3 ком­по­нент­а ком­пле­мен­та в те­че­ние 30 мин (метод прямой иммунофлюоресценции). С4 и С4d компоненты комплемента выявляли методом непрямой иммунофлюоресценции. После нанесения антител срезы оставляли на 45 мин при комнатной температуре или на ночь при температуре 4˚С, промывали PBS (3-5 мин) и обрабатывали 30 мин люминесцирующими антителами к Ig кролика или мышей (ИМТЕК, Москва), соответственно. За­тем вновь про­мы­ва­ли РВS в те­че­ние 3-5 мин и за­клю­ча­ли под по­кров­ное стек­ло в 60% ней­траль­ный гли­це­рин. С це­лью пре­до­хра­не­ния сре­зов от вы­го­ра­ния в лю­ми­нес­цент­ном мик­ро­ско­пе в гли­це­рин до­бав­ля­ли па­ра-фе­ни­лен­диа­ми­н [Лейси А., 1992]. Для кон­тро­ля од­но­вре­мен­но про­во­ди­ли изу­че­ние крио­стат­ных сре­зов, ок­ра­шен­ных ге­ма­ток­си­ли­ном и эо­зи­ном в све­то­вом мик­ро­ско­пе.



Мониторинг экспрессии некоторых белков кожи при аутоиммунных буллезных дерматозах осуществлялся с помощью методов непрямой иммунофлюоресценции и ферментной метки с использованием моноклональных или поликлональных антител (табл. 1). В непрямой иммунофлюоресценции применяли люминесцирующие сыворотки против иммуноглобулинов мыши или кролика (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН РФ; ИМТЕК, Москва). В методе ферментной метки - сыворотки против иммуноглобулинов мыши или кролика, меченные пероксидазой (ИМТЕК, Москва).

Серийные криостатные срезы толщиной 4-5 мкм готовили в криостате (минус 20˚С) и использовали в нефиксированном или фиксированном виде (см. табл. 1). Подсушивали, промывали PBS (pH 7,0-7,5) в течение 3-5 мин с



Таблица 1.

НЕКОТОРЫЕ БЕЛКИ КОЖИ (АНТИГЕНЫ-МИШЕНИ) И УСЛОВИЯ ИХ ВЫЯВЛЕНИЯ

Антигены


Антитела

Наименование

Фирма

производитель



Разведе

ние

Условия

обработки криостатных срезов

Условия обработки криостатных срезов МкАТ/ ПкАТ

Условия обработки криостатных срезов люминесцирующей сывороткой/сывороткой, меченной пероксидазой

Антигены системы межклеточного соединения (десмосом) и цитоскелета кератиноцитов

МкАТ против

кадгеринового

комплекса


Anti-pan


Cadherin¹

SIGMA, США



1:500


Фиксация в 100% холодном (4°С) ацетоне в течение

10 мин


18 ч во влажной камере при 4°С

50-60 мин во влажной камере в термостате при 37,0-37,2°С

МкАТ против десмосомального протеина


Anti-desmosomal protein¹



SIGMA, США



1:500


Фиксация в 100% холодном (4°С) ацетоне в течение

20 мин


45 мин во влажной камере при комнатной температуре или в термостате при 37,0-37,2°С, или 18 ч при 4°С

30 мин во влажной камере при 37,0-37,2°С

МкАТ к


цитокератину 5*

А6/1¹


НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ, Москва

1:10

Без обработки

18 ч во влажной камере при 4°С



30 мин во влажной камере при комнатной температуре


Антигены базальной мембраны эпидермиса

ПкАТ антитела к коллагену IV типа



Сыворотка против коллагена IV типа человека²

ИМТЕК, Москва



1:10

Без обработки


45 мин во влажной камере при комнатной температуре или 18 ч при 4°С

30 мин во влажной камере при комнатной температуре

МкАТ к белковому комплексу lamina densa базальной мембраны эпидермиса*

М6¹


НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ, Москва

1:10

Без обработки

18 ч во влажной камере при 4°С


30 мин во влажной камере при комнатной температуре





Антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA)

МкАТ к

HLA I класса



ICO-53¹

МЕДБИОСПЕКТР,

Москва


1:50

Без обработки

18 ч во влажной камере при 4°С

30 мин во влажной камере при комнатной температуре

МкАТ к


HLA II класса

ICO-1¹


МЕДБИОСПЕКТР,

Москва


1:50


Последовательная фиксация в 50% и 100% холодном (4°С) ацетоне по 10 мин

18 ч во влажной камере при 4°С


30 мин во влажной камере при комнатной температуре


1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©zubstom.ru 2015
обратиться к администрации

    Главная страница