Аутоиммунных буллезных дерматозов



страница3/6
Дата26.08.2015
Размер0,81 Mb.
1   2   3   4   5   6

Примечание: МкАТ – моноклональные антитела; ПкАТ – поликлональные антитела. 1) – мышиные антитела; 2) – кроличьи антитела

* - МкАТ любезно предоставлены Э.И.Дробышевской

последующим нанесением антител на срезы. После каждой инкубации препараты промывали в течение 3-5 мин PBS (pH 7,0-7,5), подсушивали и при использовании метода непрямой иммунофлюоресценции заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Исследовали препараты с помощью люминесцентного микроскопа LABORLUX фирмы LEIKA с объективом х 40.

При использовании метода ферментной метки после инкубации препаратов с сывороткой, меченной пероксидазой, промывали в течение 3-5 мин PBS (pH 7,0-7,5), подсушивали и наносили свежеприготовленный раствор 3,3-диаминобензидина – DAB (SIGMA, США) на 10-15 мин. Затем вновь промывали в течение 3-5 мин PBS (pH 7,0-7,5) и наносили для усиления окрашивания 0,5% раствор осмия на 30 сек с последующей промывкой в течение 2-4 мин PBS (pH 7,0-7,5) и в течение 1 мин дистиллированной водой. Далее срезы докрашивали 1% раствором альциановым синим или гематоксилином и эозином и заключали под покровное стекло в канадский бальзам. Препараты изучали в световом микроскопе (МИКРОМЕД-2, Санкт-Петербург).

Ста­ти­сти­че­ская об­ра­бот­ка. Статистическая обработка полученных данных проведена на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Office Excel 2003», «БИОСТАТ», «Statistica 6.0 for Windows».

Результаты представлены в абсолютных значениях и относительных частотах. В ходе работы были составлены таблицы сопряжения (частотные таблицы), результаты которых обрабатывали с помощью статистического анализа категорированных данных. Для выявления различий между группами использовали критерий ² и точный критерий Фишера с построением четырехпольных таблиц. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,05.

Применяли также корреляционный анализ по Пирсону. При анализе корреляции симптома Никольского с отложениями иммунных комплексов в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами считали ее незначимой при значении модуля коэффициента корреляции от 0 до 0,3; значимой - от 0,3 до 0,75; высокой – выше 0,75.

Для выявления зависимости клинической формы пузырчатки от локализации иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах и степенью интенсивности иммунофлюоресцентной реакции использовали однофакторный анализ с расчетом коэффициента корреляции (r) и его уровня значимости (p).


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Аутоиммунные буллезные дерматозы – это хронические заболевания, связанные с иммунным ответом против собственных структурных белковых компонентов, которые участвуют в поддержании межклеточных и клеточно-матриксных контактов (адгезия) многослойного плоского эпителия.

На основании клинических, гистопатологических и иммунопатологических критериев, аутоиммунные буллезные дерматозы делят на три группы - пузырчатка, буллезный пемфигоид и приобретенный буллезный эпидермолиз [Eming R., Hertl M., 2006]. Однако такое деление аутоиммунных буллезных дерматозов условно, т.к. и до настоящего времени продолжаются поиски по изучению их патогенетических механизмов на молекулярно-биологическом уровне.

Группа аутоиммунной пузырчатки включает в себя угрожающие жизни буллезные дерматозы, характеризующиеся образованием внутриэпидермального пузыря в результате потери адгезии кератиноцитов, и ассоциируется с аутоантителами к антигенам десмосом (система межклеточных соединений или межклеточная субстанция по старой терминологии). Буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз характеризуются наличием субэпидермального пузыря в результате потери прикрепления кератиноцитов базального слоя к базальной мембране и ассоциируется с отложениями иммунных комплексов в зоне базальной мембраны или дермо-эпидермальном соединении. Патогенетическая роль аутоантител, уже доказанная клиническими наблюдениями, окончательно подтверждена и продемонстрирована экспериментально. Эти аутоантитела обладают высокой тканевой специфичностью и относятся к классу иммуноглобулинов G и/или А. Антигенами-мишенями при этом являются различные молекулы десмосомального аппарата (кадгерины, плакины) и белковые компоненты базальной мембраны эпидермиса (молекулы полудесмосом, ламинины, коллаген VII типа) при аутоиммунной пузырчатке и аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения, соответственно.

Учитывая разнообразие клинических и нередко атипичных форм проявлений аутоиммунных буллезных дерматозов, клиницисты все чаще сталкиваются с необходимостью использования дополнительных методов исследования для постановки точного диагноза, а также дифференциальной диагностики с целью назначения адекватных схем лечения. Благодаря изучению аутоиммунных буллезных дерматозов на молекулярно-биологическом уровне стало возможным более широкое и углубленное исследование патогенеза этих заболеваний на современном этапе и расширение практических клинических знаний. Учитывая выше отмеченное, мы провели оценку чувствительности и специфичности клинического симптома Никольского, а также методов иммунофлюоресценции как наиболее перспективных методов диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов. На молекулярно-биологическом уровне с использованием специфических поликлональных и моноклональных антител к антигенам различных структур многослойного плоского эпителия были изучены некоторые стороны патогенеза аутоиммунных буллезных дерматозов и тем самым найдены дополнительные маркеры, позволяющие провести их дифференциальную диагностику при поэтапном обследовании больного.

Работа выполнена на базе данных клинического обследования и изучения биопсийного материала 267 больных аутоиммунными буллезными дерматозами, из них 164 больных аутоиммунной пузырчаткой, 89 – буллезным пемфигоидом, 5 – линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом и 9 – приобретенным буллезным эпидермолизом. Каждое заболевание служило контролем по отношению друг к другу. Многолетняя динамика заболеваемости (1992-2006 г.г.) в Московской области продемонстрировала устойчивую тенденцию к постепенному увеличению роста числа больных аутоиммунными буллезными дерматозами (рис. 1).



Рисунок 1. Многолетняя динамика общей заболеваемости аутоиммунными буллезными дерматозами на основе календарных лет.
Основную группу из них составляли больные с аутоиммунной пузырчаткой (61,4%) и буллезным пемфигоидом (33,3%). Линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз (1,9%) и приобретенный буллезный эпидермолиз (3,4%) диагносцировались крайне редко (рис.2).

Среди больных, страдающих аутоиммунными буллезными дерматозами, были как мужчины, так и женщины в возрасте от 18 до 87 лет (средний возраст 61,8±14,5 лет). Женщины страдали чаще, чем мужчины (соотношение женщин к мужчинам составляет 2,5:1). При этом пик заболеваемости у женщин приходился на возраст от 61 года до 70 лет, а у мужчин – от 51 года до 60 лет (рис. 3).





Рисунок 2. Процентное соотношение аутоиммунных буллезных дерматозов по отношению друг к другу.



Рисунок 3. Заболеваемость аутоиммунными буллезными дерматозами среди мужчин и женщин с учетом возрастных категорий.
Среди факторов, способствующих развитию аутоиммунных буллезных дерматозов, отмечены избыточная инсоляция (26,6%), стрессовые ситуации (22,1%) и прием лекарственных препаратов, в том числе и антибиотиков (17,2%). Учитывая, что одним из провоцирующих факторов возникновения данной патологии может быть неоплазия, всем больным было проведено комплексное обследование. Сочетание буллезного дерматоза на фоне неопластического процесса было выявлено у 16 (6%) больных из 267. При этом в структуре аутоиммунной пузырчатки частота сочетания с неоплазией составила 6,1% (рис. 4), буллезного пемфигоида – 4,5% (рис. 5), приобретенного буллезного эпидермолиза – 22,2% (рис. 6). При линейном IgA-зависимом буллезном дерматозе неоплазии выявлено не было ни в одном случае.



Рисунок 4. Клинические варианты аутоиммунной пузырчатки.


Рисунок 5. Клинические варианты буллезного пемфигоида.



Рисунок 6. Клинические варианты приобретенного буллезного эпидермолиза.

Кроме того, при комплексном обследовании больных выявлена ассоциация аутоиммунных буллезных дерматозов с другими аутоиммунными заболеваниями и патологическими процессами, сопровождающимися аутоиммунными реакциями. Это сахарный диабет II типа (74 случая - 27,7%), аутоиммунный тиреоидит и ревматоидный артрит (по 33 случая - 12,4%), анемия (22 случая - 8,2%) и бронхиальная астма (18 случаев - 6,7%) (рис. 7). Необходимо отметить также, что все аутоиммунные буллезные дерматозы протекали на фоне патологии со стороны сердечно-сосудистой системы (гипертоническая болезнь) и/или желудочно-кишечного тракта (холецистит, панкреатит, гастродуоденит).





Рисунок 7. Ассоциация аутоиммунных буллезных дерматозов с другими болезнями.
Постановка диагноза с момента проявления первых признаков заболевания составляла от 1 месяца до 5 лет, в среднем – около шести месяцев. У большинства больных аутоиммунными буллезными дерматозами патологический процесс локализовался преимущественно на коже (93,6%) с одновременным вовлечением слизистых оболочек органов в 53,2% случаев. В отдельных случаях (6,4%) было отмечено поражение только слизистой оболочки полости рта без клинических проявлений на коже. Кроме того, как и большинством авторов [Castanet J. et al., 1990; Hertl M., 2004; Vaillant L., 1991], нами отмечено, что клиническая картина аутоиммунных буллезных дерматозов на современном этапе претерпевает эволюцию. Нередко наблюдается не только клиническое сходство среди разных аутоиммунных буллезных дерматозов (например, как в случае линейного IgA-зависимого буллезного дерматоза и буллезного пемфигоида), но и клиническая имитация другими кожными заболеваниями, такими как многоформная экссудативная эритема, синдром Стивенса-Джонсона, синдром Лайела, пруриго, герпетиформный дерматит Дюринга. Такое разнообразие клинических проявлений можно наблюдать и в случаях аутоиммунных буллезных дерматозов, протекающих на фоне неоплазии, и в период продромального развития буллезного пемфигоида с его атипичными проявлениями. Все это не способствует своевременной постановке клинического диагноза и вынуждает клинициста прибегать к использованию различных диагностических методов. Одним из первых методов является симптом Никольского в двух его модификациях («прямой» и «косвенный»). Его сущность заключается в механической отслойке эпидермиса вследствие разрыва межклеточных контактов (акантолиз) и образования внутриэпидермальных пузырей, как следствие цитотоксического действия аутоантител. Высокая специфичность данного симптома позволяет непосредственно у постели больного заподозрить такое угрожающее жизни заболевание как аутоиммунная пузырчатка. Однако отрицательные результаты в ряде случаев аутоиммунной пузырчатки (28%) и выявление подобного симптома при других аутоиммунных буллезных дерматозах, таких как буллезный пемфигоид (3,4%) и приобретенный буллезный эпидермолиз (66,7%) не позволяет провести дифференциальную диагностику между этими дерматозами. Подобные наблюдения описаны и другими авторами [Глухенький Б.Т. и др., 2003; Grunwald M.H. et al., 1984; Polifka M., Krusinski P.A., 1980; Urbano F.L., 2000]. Такое «необычное поведение» феномена Никольского требует научно-обоснованного подхода к его оценке с точки зрения иммунопатологии. В стратегических целях это будет обсуждено ниже.

При сомнительных результатах симптома Никольского как первого диагностического «инструмента» в руках клинициста врач вынужден обращаться к лабораторно-диагностическим исследованиям. Наиболее простыми и доступными для лечебных учреждений являются цитологический и патоморфологический методы исследования. Однако и здесь в ряде случаев возникают сложности в постановке точного диагноза. Так, на наш взгляд цитологическое исследование содержимого пузыря или мазков-отпечатков материала со дна эрозий недостаточно информативно, т.к. акантолитические клетки (клетки Тцанка), характерные для аутоиммунной пузырчатки, обнаруживаются не только при этой патологии (76,2%), но и при буллезном пемфигоиде (9,9%) и приобретенном буллезном эпидермолизе (11,1%). Подобные наблюдения описывают и при других болезнях кожи [Глухенький Б.Т., Грандо С.А., 1990].

Патоморфологическое исследование биопсийного материала из очага поражения позволило выявить типичную морфологическую картину пузырчатки в 79,9% случаев, буллезного пемфигоида в 83,1% случаев и ни в одном случае линейного IgA-зависимого буллезного дерматоза и приобретенного буллезного эпидермолиза. В двух последних случаях патоморфологическая картина соответствовала буллезному пемфигоиду. Наш диагноз основывался на иммунологических и иммуногистохимических критериях. Несмотря на достаточно высокую информативность гистологического метода, сходные морфологические изменения обязывают дерматологов обращаться к более совершенным и надежным методам исследования с использованием прямой и непрямой иммунофлюоресценции с целью выявления циркулирующих аутоантител и фиксированных иммунных комплексов.

Известно, что основную патогенетическую роль при аутоиммунных буллезных дерматозах играют циркулирующие аутоантитела, направленные к антигенам-мишеням межклеточной субстанции (десмосомального аппарата) и базальной мембраны многослойного плоского эпителия при аутоиммунной пузырчатке и аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения, соответственно (табл. 2). Эти аутоантитела, образуя иммунные комплексы в тканях, оказывают на нее цитотоксическое действие. При аутоиммунной пузырчатке это приводит к разрушению межклеточных контактов с последующим разрывом связей между отдельными клеточными элементами, развитию акантолиза и образованию внутриэпидермальных пузырей. При аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения (приобретенный буллезный эпидермо-


Таблица 2.

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА ПРИ АУТОИММУННЫХ БУЛЛЕЗНЫХ ДЕРМАТОЗАХ




Титры

аутоантител к

Диагноз


Аутоиммунная

Пузырчатка


Паранеопластическая

Пузырчатка


Буллезный

пемфигоид


Линейный IgA-зависимый

буллезный дерматоз


Приобретенный

буллезный

эпидермолиз


Приобретенный

буллезный

эпидермолиз

паранеопласти-ческого генеза

антигенам межклеточной субстанции многослойного плоского эпителия (эпидермис, пищевод)


1:5-1:10240*


1:10-1:256*

1:10**






1:10**


антигенам базальной мембраны эпидермиса

1:10-1:20**

1:10-1:40**

1:10-1:128*

1:20*

1:10-1:320*

1:10*

антигенам различных структур эпидермиса и дермы




1:20-1:80**

1:10**




1:10-1:80**




антигенам изотропных дисков скелетной мускулатуры

1:10-1:80**

1:10-1:320**













антигенам межклеточной субстанции телец Гассаля тимуса человека или животных


1:10-1:80*


1:10-1:80*













антигенам миоидных клеток тимоцитов




1:10-1:80**













Антинуклеарный фактор




1:40-1:320**













антигенам базальной мембраны гепатоцитов

1:10-1:80**
















антигенам соединительнотканных структур печени


1:10-1:320**















антигенам дисков поперечнополосатой мускулатуры

1:5-1:10**


1:10-1:320**















антигенам капилляров миокарда

1:10-1:80**

1:10-1:320**













Примечание: * - циркулирующие аутоантитела, ответственные за развитие аутоиммунного буллезного дерматоза; ** - сопутствующие антитела к антигенам различных структур тканей и органов.
Достоверных различий по частоте встречаемости аутоантител к антигенам межклеточной субстанции и базальной мембраны при аутоиммунной пузырчатке и паранеопластической пузырчатке выявлено не было (p>0,05). Однако надо отметить, что титр аутоантител был достоверно выше при аутоиммунной пузырчатке (1:586 и 1:30 к антигенам межклеточной субстанции и базальной мембране, соответственно), чем при паранеопластической пузырчатке (1:40 к антигенам межклеточной субстанции). Частота выявления циркулирующих аутоантител к антигенам различных структур эпидермиса и дермы, изотропных дисков скелетной мускулатуры, миодных клеток тимоцитов, соединительно-тканных структур печени и ядрам ее клеточных элементов (АНФ), дисков поперечно-полосатой мускулатуры и капилляров миокарда была достоверно выше при паранеопластической пузырчатке, чем при аутоиммунной пузырчатке (p<0,05). При этом титр аутоантител к антигенам дисков поперечно-полосатой мускулатуры (1:118), капиллярам миокарда (1:118) и АНФ (1:25) при паранеопластической пузырчатке было достоверно выше (p<0,05), чем при аутоиммунной пузырчатке.

лиз, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, приобретенный буллезный эпидермолиз) под действием специфических аутоантител и фиксированных иммунных комплексов происходит разрушение структурных компонентов базальной мембраны с последующим ее расщеплением и образованием подэпидермальных пузырей.

Некоторые авторы считают, что определение титров антител и выявление в тканях фиксированных иммунных комплексов во многих случаях позволяет не только подтвердить диагноз, но и прогнозировать дальнейшее течение заболевания [Ежов Н.Я., 1974; Friedman H. Et al., 1989; Sams W.M.Jr., Jordon R.E., 1971; Titzpatrick R.E., Newcomer V.D., 1980]. В наших исследованиях с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции специфические аутоантитела в сыворотке крови больных различными аутоиммунными буллезными дерматозами были выявлены в 80,3% случаев. При этом титры антител (от 1:5 до 1:10240) не всегда коррелировали с клиническими проявлениями. Это связано со способностью кожи сорбировать иммунные комплексы с целью их элиминации. Поэтому при обширных поражениях кожи, порой с захватом целых анатомических областей и слизистой оболочки, циркулирующие аутоантитела не всегда удается выявить, особенно в случаях аутоиммунной пузырчатки (65,8%) и буллезного пемфигоида (29,4%). И, наоборот, в случае локального патологического процесса титр аутоантител может достигать высоких цифр до 1:10240.

Кроме основных патогенетически значимых антител в ряде случаев были выявлены «дополнительные» антитела (см. табл. 2). Так, при паранеопластической пузырчатке выявлен широкий спектр антител к антигенам многих структур органов и тканей, таких как миоидные клетки тимуса, диски поперечнополосатой мускулатуры, капилляры миокарда, соединительнотканные структуры печени и ядра ее клеточных элементов (гепатоцитов). Это объясняет тяжесть и разнообразие клинических проявлений болезни, протекающей на фоне неоплазии. Кроме того, наличие «мозаики» антител при данной форме патологии позволяет рассматривать паранеопластическую пузырчатку как мультиорганный синдром. Об этом имеется ряд сообщений и других авторов [Lane J.E. et al., 2004; Nguyen V.T. et al., 2001].

В случаях приобретенного буллезного эпидермолиза выявлено, что патогенетическую роль могут играть или IgG, или IgG и IgA антитела одновременно. При этом антигенами-мишенями могут быть молекулярные соединения и lamina densa, и lamina lucida. Вовлечение последней, по-видимому, связано с опосредованным влиянием этих аутоантител на адгезивную функцию молекул.

Если циркулирующие аутоантитела при аутоиммунных буллезных дерматозах не всегда удается выявить в связи с иммунной сорбцией в тканях, то фиксированные иммунные комплексы были обнаружены во всех исследованных случаях (100%). При этом наряду с основными иммуноморфологическими диагностическими признаками каждого аутоиммунного буллезного дерматоза выявлен ряд дополнительных интересных фактов. Известно, что одним из диагностических маркеров аутоиммунной пузырчатки является обнаружение иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах эпидермиса (p<0,05) (рис. 8). При вульгарной и вегетирующей пузырчатке фиксация иммуноглобулина класса G наблюдается в межклеточных пространствах шиповатого слоя, а при себорейной и листовидной пузырчатке - в зернистом слое эпидермиса. Однако в наших исследованиях была выявлена несколько иная иммуногистохимическая картина. Так, при пузырчатке независимо от клинических форм ее проявления в патологический процесс всегда были вовлечены антигены десмосомального аппарата шиповатого слоя. При этом в случаях вульгарной пузырчатки в патологический процесс одновременно вовлекалось и межклеточное пространство базального слоя эпидермиса (p=0,032), а в случаях листовидной или себорейной пузырчатки – межклеточное пространство зернистого слоя с наиболее интенсивной иммуногистохимической реакцией в ней (p=0,027 и p=0,000012, соответственно).






1   2   3   4   5   6


База данных защищена авторским правом ©zubstom.ru 2015
обратиться к администрации

    Главная страница