Плеоморфные саркомы: морфология, молекулярно-биологические и клинические свойства



страница1/5
Дата27.08.2015
Размер0,68 Mb.
  1   2   3   4   5


На правах рукописи


БЛИЗНЮКОВ ОЛЕГ ПЕТРОВИЧ
ПЛЕОМОРФНЫЕ САРКОМЫ: МОРФОЛОГИЯ, МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ И

КЛИНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
(14.01.12 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

www.rncrr.ru

Москва - 2012 г.
Работа выполнена в ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения РФ
Научный консультант:

член-корреспондент РАМН, профессор Солодкий Владимир Алексеевич


Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор Харченко Наталья Владимировна,

ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки России,

кафедра онкологии и рентгенологии, зав. кафедрой

- доктор медицинских наук, профессор Самойленко Вячеслав Михайлович, Военно-медицинское управление ФСБ РФ, главный онколог

- доктор медицинских наук, профессор Абросимов Александр Юрьевич, ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздрава России, зав. клинико-морфологическим отделом



Ведущая организация:

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина» РАМН

Защита состоится «25» февраля 2013 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.081.01 при ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения РФ по адресу: 117997, г. Москва, ул. Профсоюзная, д. 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения РФ


Автореферат разослан « » января 2013 г.
У

ченый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор З.С.Цаллагова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Злокачественные опухоли мягких тканей составляют, по данным «Статистики злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2007 году» 0,67% всех злокачественных опухолей, ежегодно это около 3245 новых случаев сарком. Близкую частоту заболеваемости имеют рак щитовидной железы, герминогенные опухоли яичка и лимфома Ходжкина.

Плеоморфные саркомы - это группа, состоящая из низкодифференцированных мезенхимальных опухолей разного гистогенеза, к которым относят плеоморфную липосаркому, рабдомиосаркому, лейомиосаркому, фибросаркому, низкодифференцированную миксофибросаркому и злокачественную фиброзную гистиоцитому/недифференцированную плеоморфную саркому.

Плеоморфные саркомы - относительно редкие опухоли, составляющие, по разным оценкам, от 5 до 7% всех сарком. Они мало изучены с точки зрения морфологии, молекулярной биологии и клиники в силу того, что формирование большой группы наблюдений представляет собой сложную задачу, решить которую возможно только в крупных медицинских центрах, занимающихся вопросами ортопедической и абдоминальной онкологии.

Плеоморфные саркомы клинически агрессивные опухоли, естественное течение которых сопровождается быстрым ростом и ранним появлением метастазов. Более половины обратившихся за медицинской помощью больных плеоморфными саркомами имеют третью клиническую стадию заболевания, а пятая часть больных метастазы в легких. Для лечения плеоморфных сарком используются хирургический метод, лучевая терапия и химиотерапия в различных режимах и комбинациях. Несмотря на применение всех современных методов лечения, пятилетняя выживаемость больных плеоморфными саркомами остается низкой и колеблется, в зависимости от гистологического типа саркомы, от 29 до 68%.

Низкая эффективность лечения объясняется, отчасти, плохим качеством диагностики плеоморфных сарком. Эти опухоли не имеют специфических клинических, лучевых и сонографических признаков, поэтому рентгенологические и ультразвуковые методы исследования не имеют самостоятельного значения в диагностике плеоморфных сарком. Единственным способом, который позволяет установить нозологическую форму опухоли, является морфологическое исследование материала биопсии. Гистологический тип плеоморфной саркомы является главным прогностическим фактором, который определяет метод лечения опухоли и ее клинические исходы. Точность морфологического диагноза плеоморфных сарком при исследовании материала пункционных биопсий остается неудовлетворительной, она колеблется в пределах от 13 до 26%. На практике это означает, что гистологический тип плеоморфной саркомы правильно определяют лишь у четверти больных, что примерно в три раза ниже точности диагноза сарком костей.

Трудности морфологической диагностики плеоморфных сарком носят объективный характер. Большое разнообразие тканей – источников развития плеоморфных сарком, создает чрезвычайно сложную гистологическую картину и крайне затрудняет определение гистогенеза опухоли. Диагностика плеоморфных сарком является наукоемким разделом патологической анатомии и онкологии. При рутинном гистологическом исследовании определить нозологическую форму опухоли можно не более чем в 5% случаев, поэтому практически всегда требуется применение специальных методов исследования - иммуноморфологии, электронной микроскопии, цитогенетики, молекулярной генетики. Тем не менее, широкое внедрение высокотехнологичных методов исследования не решает всех проблем. Нозологическая структура плеоморных сарком очень подвижна, гистологическая классификация этих опухолей меняется, примерно, раз в десятилетие. Сегодня нет единого мнения о гистологической классификации плеоморфных сарком – в «Классификации опухолей мягких тканей и костей» (ВОЗ, 2002 г.) они не объединены в отдельную группу опухолей. Некоторые плеоморфные саркомы, не смотря на их клиническую значимость, до сих пор не выделены в принятой классификации в виде отдельных нозологических форм, а рассматриваются в качестве редких морфологических вариантов сарком соответствующего строения.

Важность установления гистологического типа плеоморфной саркомы до начала лечения определяется тем, что хирургическое лечение этих опухолей травматично - предпринимаются калечащие вмешательства, вплоть до ампутации и экзартикуляции конечности. Точная гистологическая и одновременно молекулярная трактовка плеоморфных сарком открывает путь для селективной терапии этих опухолей. Исследование сигнальных путей активации генов в саркомах определенных гистологических типов показало, что эти сигнальные пути отличаются, а к некоторым из них - PiК3/mTOR, -catenin, c-kit, VEGFR2 уже получены специфические фармакологические ингибиторы.

С точки зрения клиники имеет значения тот факт, что практически невозможно предсказать клинические исходы той или иной плеоморфной саркомы. Классические представления онкологов о размере узла, гистологической степени злокачественности и анатомической локализации опухоли здесь не работают. Почти все плеоморфные саркомы – низкодифференцированные опухоли, с размером узла более пяти сантиметров, располагающиеся субфасциально, в мягких тканях конечностей, туловища или в забрюшинном пространстве. Единственным значимым прогностическим фактором является гистологический тип плеоморфной саркомы, что еще раз подчеркивает важность правильного морфологического диагноза этих опухолей.

Все это делает необходимым детальное изучение морфологии, молекулярно-биологических, клинических свойств и исходов плеоморфных сарком.


ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить морфологию, молекулярно-биологические и клинические свойства плеоморфных сарком.


ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Уточнить и систематизировать критерии гистологической, иммуноморфологической, ультраструктурной и молекулярно-биологической диагностики опухолей из группы плеоморфных сарком.

2. Провести ретроспективный морфологический анализ сарком, диагностированных ранее как «злокачественные фиброзные гистиоцитомы», с целью выделения из этой группы плеоморфных сарком определенного гистологического типа.

3. Дополнить существующую гистологическую классификацию плеоморфных сарком за счет включения в нее новых нозологических форм.

4. Определить возможности и ограничения методов электронной микроскопии, иммуногистохимии, цитогенетики и молекулярной генетики в диагностике плеоморфных сарком.

5. Изучить этиологию, локализацию и анатомические типы роста отдельных нозологических форм плеоморфных сарком взависимости от пола и возраста больных.

6. Охарактеризовать частоту рецидивов, метастазов плеоморфных сарком и выживаемость больных, а аткже непосредственные причины их смерти в зависимости от гистологического типа саркомы. Выявить морфологические факторы, которые влияют на клинические исходы плеоморфных сарком.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В настоящей работе впервые:

1. Систематизированы критерии гистологической, иммуноморфологической, ультраструктурной, цитогенетической и молекулярно-биологической диагностики отдельных нозологических форм плеоморфных сарком.

2. Определены возможности и ограничения специальных методов исследования материала биопсий плеоморфных сарком – электронной микроскопии, иммуногистохимического, цитогенетического и молекулярно-биологического исследования.

3. Установлено, что недифференцированная плеоморфная саркома/злокачественная фиброзная гистиоцитома является самостоятельной нозологической формой, которая составляет 11% всех плеоморфных сарком.

4. Выявлено, что плеоморфная лейомиосаркома, плеоморфная фибросаркома и плеоморфные опухоли из оболочек периферических нервов являются самостоятельными нозологическими формами, а не морфологическими вариантами строения соответствующих сарком.

5. Показано, что плеоморфные рабдомиосаркомы и недифференцированные плеоморфные саркомы/злокачественные фиброзные гистиоцитомы обладают худшими клиническими исходами, нежели остальные плеоморфные саркомы.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Систематизированы критерии гистологической, иммуноморфологической, ультраструктурной и молекулярно-биологической диагностики опухолей из группы плеоморфных сарком.

Определены возможности и ограничения методов иммуногистохимии, электронной микроскопии, цитогенетики и молекулярной генетики в диагностике плеоморфных сарком.

Предложена дополненная морфологическая классификация плеоморфных сарком.

Проведен сравнительный анализ клинических исходов плеоморфных сарком в зависимости от гистологического типа, выделены нозологические формы сарком с наимее благоприятными клиническими исходами.

Охарактеризованы непосредственные причины смерти больных плеоморфными саркомами.


ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Наиболее часто встречающейся плеоморфной саркомой является низкодифференцированная миксофибросаркома, далее с одинаковой частотой следуют плеоморфные липосаркома, лейомиосаркома и опухоли из оболочек периферических нервов. Редкими формами плеоморфных сарком являются плеоморфные рабдомиосаркома и фибросаркома. Недифференцированная плеоморфная саркома/злокачественная фиброзная гистиоцитома является самостоятельной нозологической формой и составляет 11% всех плеоморфных сарком.

2. Плеоморфную лейомиосаркому, плеоморфную фибросаркому и плеоморфную опухоль из клеток оболочек периферических нервов следует считать самостоятельными нозологическими формами, а не морфологическими вариантами строения соответствующих сарком.

3. Гистологический тип плеоморфной саркомы является главным фактором, определяющим клинические исходы опухоли.

4. Наименее благоприятные клинические исходы имеют плеоморфная рабдомиосаркома, плеоморфная липосаркома и недифференцированная плеоморфная саркома/злокачественная фиброзная гистиоцитома.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Материал диссертации изложен на 204 страницах. Работа состоит из пяти глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение результатов», «Выводы». Диссертация содержит 9 таблиц и 93 рисунка. Библиографический список включает 136 работ, из них 2 отечественных и 134 иностранных авторов.




ПУБЛИКАЦИИ

Материалы диссертации опубликованы в 21 печатной работе. Результаты работы доложены в виде тезисов и доклада на 5-м Конгрессе онкологов и радиологов стран СНГ (14-16 мая, Ташкент, 2008 г.).


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Общая характеристика клинических наблюдений

Исследован материал 263 больных плеоморфными саркомами. Материал включал пункционные и инцизионные биопсии, блоки тканей и целые конечности, удаленные во время операций в Российском научном центре рентгенорадиологии МЗ РФ (58 случаев), Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (147 случаев) и Главном военном клиническом госпитале им. Н.Н.Бурденко МО РФ (12 случаев), а также консультативный материал, присланный из других лечебных учреждений РФ (46 случаев). Среди больных 131 мужчина и 132 женщины.

Изучены десять форм опухолей, входящих в группу плеоморфных сарком: низкодифференцированная (G3) миксофибросаркома (71 случай), плеоморфная лейомиосаркома (45 случаев), плеоморфная липосаркома (42 случая), плеоморфная опухоль из клеток оболочек периферических нервов (44 случая), плеоморфная рабдомиосаркома (7 случаев), плеоморфная фибросаркома (11 случаев), недифференцированная плеоморфная саркома (29 случаев), остеосаркома, в том числе внескелетная остеосаркома (8 случаев), злокачественная воспалительная миофибробластическая опухоль (4 случая), злокачественная гигантоклеточная опухоль мягких тканей (2 случая). Критерием включения той или иной саркомы в исследование служил диагноз патологоанатома после комплексного морфологического исследования материала: «злокачественная фиброзная гистиоцитома», «плеоморфная саркома» и «недифференцированная саркома». Участки плеоморфного строения составляли в гистологических препаратах не менее 50-75% площади ткани опухоли. Саркомы типичного (не-плеоморфного) строения в исследование не включены.

Данные об анамнезе, клиническом течении, лечении и исходах заболеваний получены из карт стационарных и амбулаторных больных, выписок из карт и направлений на гистологическое исследование материала. Клинические характеристики включали данные о частоте встречаемости нозологической формы, возрасте больного, локализации опухоли, стадии заболевания, сведения о проведенном лечении и клиническом исходе заболевания.

Данные о проведенном лечении доступны для 219 из 263 больных (83,3%). Больным проведено: (1) хирургическое лечение, включавшее фасциально-футлярное иссечение опухоли, ампутацию, экзартикуляцию конечности, резекцию грудной стенки, удаление опухоли головы, шеи, забрюшинного пространства, средостения с прилежащими анатомическими структурами; (2) комбинированное лечение, включавшее неоадъювантную лучевую терапию и химиотерапию.

Данные о клинических исходах заболевания доступны для 112 из 263 больных (42,6%). Срок наблюдения за больными составлял от 2 месяцев до 5 лет.

Для определения локализации, размеров и анатомического распространения опухоли использовали лучевые методы исследования: рентгенографию, компьютерную томографию с контрастированием сосудов, магнитно-резонансную томографию в режимах Т1 и Т2-взвешенных изображений.

Клиническую стадию заболевания (А-V) определяли согласно Классификации TNM (7-я редакция, 2009 год), раздел «Опухоли мягких тканей и костей» (анатомические области С38.1-3; С47-49).

Гистологический тип (нозологическую форму) опухоли формулировали согласно «Классификации опухолей мягких тканей и костей», предложенной экспертами ВОЗ (3-я редакция, 2002 г.). Гистологическую степень злокачественности плеоморфных сарком (G) определяли с помощью трехуровневой системы French Federation of Cancer Centers (FNCLCC). Система включает количественную оценку (в баллах) следующих параметров: степень дифференцировки клеток опухоли; количество митозов в ядрах клеток опухоли; площадь некроза опухоли. Гистологическая степень злокачественности (G) не зависела от гистологического типа плеоморфной саркомы, а определялась индивидуальными особенностями ее морфологии. Гистологическую степень лечебного патоморфоза плеоморфных сарком определяли с помощью системы A.Huvos, которая основана на учете площади, которую занимают пригодные к идентификации («живые») опухолевые клетки. Для характеристики качества морфологического исследования биопсийного материала использованы понятия информативность, чувствительность и точность морфологического исследования.

Исследование причин смерти (основной и непосредственной) больных плеоморфными саркомами проводили: при впервые выявленных при аутопсии, не леченных опухолях (естественное течение заболевания); при резистентности саркомы к химиотерапии или лучевой терапии и прогрессировании заболевания; при осложнениях комбинированного лечения сарком.

Проведены патологоанатомические исследования (аутопсии) тел 24 умерших больных плеоморфными саркомами. Патологоанатомические исследования тел умерших больных с плеоморфными саркомами проводили в прозектурах Российского научного центра рентгенорадиологии МЗ РФ, Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН, Главного военного клинического госпиталя им. Н.Н.Бурденко МО РФ, Городских клинических больниц №29, №40 и №56, Центральной клинической больницы РАМН, в 6-ом танатологическом отделении Бюро судебно-медицинской экспертизы г. Москвы. В каждом случае проводилось полное патологоанатомическое вскрытие трупа с извлечением комплекса органов по Шору. Патологоанатомический диагноз формулировали согласно требованием «Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем» (10-й пересмотр, 1989 г.)

Изучение материала опухолей проводили с помощью комплекса методов, включавших макроскопическое, гистологическое, ультраструктурное, иммуногистохимическое, цитогенетическое и молекулярно-биологическое исследование.



2. Макроскопическое исследование

Блоки тканей, удаленные при фасциально-футлярном иссечении опухолей (135 случаев) и ампутированные (экзартикулированные) конечности (12 случаев) рассекали серийными разрезами в плоскости, соответствующей проекции при КТ или МРТ исследовании. Размеры узла опухоли измеряли линейкой и сопоставляли с данными лучевых исследований. Типы роста опухоли – поверхностный и глубокий, определяли по отношению к поверхностной фасции конечности и туловища.



3. Гистологическое исследование

Фрагменты опухоли фиксировали в 10% растворе формалина в течение 12-24 часов, заливали в парафин и готовили на микротоме серийные срезы толщиной 3-4 мкм. Срезы окрашивали в водном растворе гематоксилина и эозина. Для выявления коллагеновых волокон гистологические срезы окрашивали методом ван Гизона (пикриновая кислота и фуксин), методом Маллори (гематоксилин и фосфорно-вольфрамовая кислота), для выявления кислых мукополисахаридов использовали метод Крейберга. При световой микроскопии определяли гистологический тип саркомы, количество митозов в клетках, площадь очагов некроза, количество и характер внеклеточного матрикса, инвазию сосудов, нервов и прилежащей нормальной ткани.

Результаты гистологического исследования пункционных и инцизионных биопсий плеоморфных сарком сравнивали с результатами исследования узлов опухолей, удаленных во время операций. В последнем случае для правильного определения гистологического типа плеоморфной саркомы применяли все доступные специальные методы исследования.

4. Иммуногистохимическое исследование

Иммуногистохимическое исследование выполнено на материале парафиновых срезов опухолей, включавших пункционные и инцизионные биопсии и фрагменты опухолей, удаленные во время операции. Проведено иммуногистохимическое исследование 247 случаев плеоморфных сарком.

Для высокотемпературного открытия антигенов в клетках опухоли использовали буферные растворы 10 мМ цитрат/NaOH, рН 6,0 и 1 мМ трис/EDTA, рН 9,0. При иммуногистохимическом исследовании ткани опухоли были использованы следующие моноклональные антитела («BioGenex», США): к цитокератинам (клон AE1/АЕ3), к эпителиальному мембранному антигену ЕМА (клон E29), к виментину (клон Vim3B4), к антигену фибробластов (клон 5В5), к десмину (клон D33), к актинам мышечных клеток (клон HHF35) и a-актину гладких мышц (клон 1A4), к калпонину (клон CALP), Н-калдесмону (клон h-CD), к миогенину (клон F5D), к CD57 (клон ТВ01), к CD68 (клон КР-1), к CD31 (клон JC70A), к CD34 (клон QBEnd10), ALK (клон ALK1), поликлональные антитела кролика к белку S100В. Рабочие разведения перечисленных антител подобраны эмпирически. Система визуализации EnVision™ Kits HRP (DAB+) («DAKO», Дания).

В зависимости от специфичности антител учитывали окрашивание мембраны, цитоплазмы или ядра клетки. Результаты иммуногистохимического исследования оценивали полуколичественным методом по соотношению окрашенных и неокрашенных клеток. Окрашивание клеток расценивали как: слабое (+) при окрашивании менее 10% клеток; умеренное (++) при окрашивании 10-50% клеток; сильное (+++) при окрашивании более 50% клеток.



5. Электронная микроскопия

Для ультраструктурного исследования использовали материал опухолей, удаленных во время операций. Проведено ультраструктурное исследование 42 плеоморфных сарком. Фрагменты ткани 5х5 мм иссекали из трех-четырех разных участков саркомы. Ткань опухоли фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида в 0,25 М натрий-фосфатном буфере рН 7,4 в течение 12 часов при 4С. Повторную фиксацию материала проводили в 1% растворе OsO4. Обезвоживание материала производили в 70-96% этиловом спирте и заливали в уплотняющую среду эпон 812. Контрастирование материала проводили насыщенным раствором уранил-ацетата в 70% этиловом спирте. Полутонкие и ультратонкие срезы производили на ультрамикротоме LKB-3 («Pharmacia», Швеция). Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим и исследовали в микроскопе. Ультратонкие срезы исследовали в электронном микроскопе JEM-100C (Япония). При необходимости, фрагменты опухоли брали из фиксированного в формалине и залитого в парафин материала.



6. Цитогенетическое исследование

Парафиновые срезы ткани опухоли толщиной 3-5 мкм погружали в 10 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7.0 при 37С на 30 мин, далее денатурировали ДНК клеток в 70% растворе формамида в 50 мM натрий-фосфатном буфере, рН 7.0 в течение 3-6 минут при 75С. Условия гибридизации нуклеотидных зондов разной специфичности были подобраны индивидуально, согласно рекомендациям производителей. Хромосомы окрашивали в растворе DAPI. Сигналы флуоресценции анализировали на РС PowerGene Image Analysis System.

Транслокация гена ALK в клетках 42 плеоморфных сарком исследовали в парафиновых срезах опухоли с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Использован зонд Vysis 2р23 LSI ALK Dual Color («Abbott», США), который предназначен для обнаружения перестроек локуса 2p23, наблюдающуюся при транслокации t(2;5) и ее вариантов. Транслокация t(2;5) приводит к формированию химерного гена ALK-NPM (нуклеоплазмин), ген которого расположен в локусе 5q35. Повышенная экспрессия химерного гена ALK-NPM наблюдается в злокачественных миофибробластических опухолях и используется для их дифференциальной диагностики. Зонд Vysis 2р23 LSI ALK Dual Color содержит меченный флуорофором олигонуклеотид, который гибридизируется с 3` 250 kb-участком гена ALK и олигонуклеотид, который гибридизируется с 5` 300 kb-участком гена ALK вблизи точки разрыва t(2;5) на хромосоме 2р23. При отсутствии транслокации гена ALK в ядрах клеток имеется один слитый – желтый сигнал, при наличии транслокации два отдельных сигнала – красный и зеленый.

Транслокация гена FUS в клетках 42 плеоморфных сарком исследовали в парафиновых срезах опухоли с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Использован зонд Vysis LSI FUS Dual Color («Abbott», США). Зонд содержит меченный флуорофором олигонуклеотид, который гибридизируется с 3` 500 kb-участком гена FUS и олигонуклеотид, который гибридизируется с 5` 270 kb-участком гена FUS вблизи точки разрыва t(16;X) на хромосоме 16р11. При отсутствии транслокации гена FUS в ядрах клеток имеется один слитый – желтый сигнал, при наличии транслокации два отдельных сигнала – красный и зеленый.

Транслокация гена CHOP в клетках 42 плеоморфных сарком исследовали в парафиновых срезах опухоли с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Использован зонд Vysis LSI DDIT3 Dual Color («Abbott», США), который предназначен для обнаружения перестройки хромосомы в локусе 12q13. Зонд содержит меченный флуорофором олигонуклеотид, который гибридизируется, с 3` 700 kb-участком гена CHOP и олигонуклеотид, который гибридизируется с 5` 660 kb-участком гена CHOP вблизи точки разрыва 12q13. При отсутствии транслокации гена CHOP в ядрах клеток имеется один слитый – желтый сигнал, при наличии транслокации два отдельных сигнала – красный и зеленый.

  1   2   3   4   5


База данных защищена авторским правом ©zubstom.ru 2015
обратиться к администрации

    Главная страница