Федеральное государственное автономное



Скачать 212,3 Kb.
Дата25.06.2015
Размер212,3 Kb.


Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»


Институт фундаментальной биологии и биотехнологии
Кафедра биофизики
УТВЕРЖДАЮ Заведующий кафедрой

_____ _____________

подпись инициалы, фамилия

« _____» _______ 2012 г.



ОТЧЕТ О ПРАКТИКЕ
Сибирский федеральный университет

место прохождения практики


Разработка экспрессного биолюминесцентного метода оценки реакции организма спортсмена на физическую нагрузку

Руководитель __________ профессор, д. б. н. Кратасюк В.А.

Студент БФ11-03М ________________ __________ Иванова Г.В.

Красноярск 2012


Оглавление


Оглавление 2

Введение 3

1 Обзор литературы 7

Состав слюны 7

Методы определения физической нагрузки 8

Аналитические методы исследования в биологии и медицине 11

Флоуресцентный метод 12

2 Объекты и методы исследования 13

Измерение люциферазного индекса (LI) 14

3 Результаты исследования 16

Для определения возможности создания метода биолюминесцентного биотестирования нагруженности организма с использованием слюны в качестве анализируемой жидкости, был проведен эксперемент показывающий влияние слюны на биферментную систему НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при разных количествах нагрузки. 16

После центрифугирования производился биолюминесцентный анализ биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при добавлении в неё 50 мкл слюны. 16

Заключение 24

Список использованных источников 25




Введение


Совершенствование системы физической подготовки требует методов индивидуализации тренировок, что возможно только при использовании объективных критериев оценки реакции организма на физическую нагрузку. Традиционные методы кардиомониторинга не дают полной картины, методы биохимического контроля инвазивны и трудоемки. Данная работа предполагает разработку метода контроля, основанной на биолюминесцентном экспресс-анализе концентрации ряда биомаркеров в слюне. Данная разработка позволит создать условия для качественных изменений в организации тренировочного процесса, что приведет к росту спортивных результатов, сохранению здоровья спортсменов. Даже в случае рационального планирования нагрузок, постоянного контроля за развитием процессов утомления и восстановления, в условиях соревновательной деятельности, далеко не всегда удается избежать перегрузок и переутомления, что чревато развитием перетренированности – явления, влияющего не только на эффективность процесса подготовки, но и на здоровье спортсмена. Если своевременно не внести коррективы в процессе подготовки, то неизбежно развитие перенапряжения со всеми вытекающими негативными последствиями.1

В последние годы значительно вырос интерес исследователей к изучению характера влияния физических нагрузок на процессы перекисного окисления у спортсменов различной специализации и разного уровня тренированности 2 В настоящее время известно несколько физиологических методов определения реакций организма человека на физическую и умственную нагрузку, такие как измерение гемодинамики, определение максимального потребления кислорода (МНК), показателей анаэробного обмена (ПАНО) и ряд других.3 К недостаткам известных методов относятся их длительность, сложность проведения анализа, трудоемкость, необходимость предварительной пробоподготовки в лаборатории, инвазивность при анализе сыворотки и плазмы крови. Получены данные, свидетельствующие о взаимосвязи динамики уровня кортизола в слюне при физических нагрузках со степенью подготовленности спортсмена. Показано, что при кратковременных высокоинтенсивных физических нагрузках происходят достоверное увеличение концентрации кортизола и уменьшение концентрации секреторного IgА. Высказано предположение о том, что базальный уровень кортизола в сыворотке крови может являться определяющим при восстановлении концентрации секреторного IgA после физической нагрузки за счет ингибирования функции лимфоцитов, макрофагов и моноцитов увеличивающимся уровнем глюкокортикоидов при воздействии физиологических стрессоров.4

Поиск методов экспрессного интегрального контроля состояния биологических систем разного уровня сложности является весьма актуальным в настоящее время и осуществляется в биотестах. Одним из таких биотестов является биолюминесцентный метод определения физической нагрузки. Этот метод осуществляется с использованием известного биофизического явления - биолюминесценции - свечение живых организмов. В методе используется интенсивность свечения биферментной системы NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза в присутствии слюны человека взятой до и после нагрузки. Отличительной чертой этого метода является то, что в качестве анализируемой жидкости используется слюна человека.

Слюна, как и кровь, является внутренней средой организма, отражающей его функциональное состояние. Биофизические модели типа «кровь-организм» успешно развиваются во многих исследовательских центрах. Модели типа «слюна-организм» или «слюна-кровь-организм» не получили развития из-за отсутствия данных о составе, взаимодействиях слюны. Однако такие модели были бы полезны как в фундаментальном, так и в практическом отношении, прежде всего в связи с чрезвычайной легкостью получения объекта исследования.

Слюна является многокомпонентной биологической жидкостью, в которой к настоящему времени не определен состав, взаимодействие между компонентами, а также связи с функциональным состоянием организма. Решением таких задач занимается биофизика сложных систем.5

Вместе с тем, простота получения образцов слюны для дальнейших анализов делает ее чрезвычайно привлекательной для исследований разными методами, в том числе биофизическими. При этом биолюминесценция может использоваться как интегральный тест взаимодействий и регуляции параметров слюны, а другие биофизические и биохимические методы создадут необходимые количественные оценки состава слюны для построения биофизической модели «организм-слюна» и ее управления 6.

Ключевые слова: кортизол,   слюна,   физическая нагрузка, биотестирование, Cortisol,  Saliva, physical activity, , bioassay

Целью работы Цель работы: Подбор условий проведения анализа, подбор условий пробоподготовки, «колибровка» результатов биолюминесцентного биотестирования с показателями эргонометра, получение спектра хроматомасспектрометрии слюны до и после нагрузки

Были поставлены следующие задачи:


  1. Обосновать на основе литературных данных выбор анализируемой жидкости.

  2. Подобрать условия для использования биолюминесцентных ферментативных биотестов для анализа биологических жидкостей (слюна, пот) у спортсменов

  3. Провести анализ биомаркеров, отражающих значимые изменения в организме при физической нагрузке.

  4. Сравнить результаты, полученные биолюминесцентным методом при анализе слюны с результатами, полученными иными экспериментальными и классическими методами с целью выявления работоспособности предлагаемого метода и его апробации в условиях тренировки.

  5. Сформулировать экспресс-метод оценки реакции организма на физическую нагрузку.


1 Обзор литературы



Состав слюны

Слюна представляет собой вязкую слегка опалесцирующую мутноватую жидкость с плотностью 1,001-1,017 г/мл [4,6]. В полость рта выделяется секрет околоушной, подчелюстной, подъязычной желёз, малых слюнных желёз, называемый смешанной слюной или ротовой жидкостью. Смешанная слюна отличается от секрета, выделяющегося непосредственно из протоков желёз, присутствием постоянной микрофлоры, в состав которой входят бактерии, грибки, спирохеты и др., а также продукты их метаболизма, слущенных эпителиальных клеток.7 В процессе биохимического контроля спортсмена слюна, как ранее отмечалось, используется не часто. В слюне определяют компоненты иммуносистемы, активность ферментов, содержание важнейших продуктов метаболизма, изменения минерального балланса, колебания рН. Существует мнение, что слюна, обладая меньшей, чем кровь, буферной емкостью, лучше отражает нарушения кислотно-щелочного равновесия в организме спортсмена. Однако как объект исследования слюна не получила широкого распространения, поскольку состав ее зависит не только от физических нагрузок и связанных с ними изменений внутритканевого обмена веществ, но и от состояния сытости при питании ("голодная" или "сытая" слюна)8

Слюна по своей природе является смешанной ротовой жидкостью и образуется большими и малыми слюнными железами9. В смешанной слюне человека обнаружены почти все элементы периодической системы химических элементов Менделеева. В состав слюны входят разнообразные минеральные вещества и соединения: анионы хлоридов, бромидов, фторидов, иодидов, фосфатов, бикарбонатов, роданидов и др. Катионы представлены ионами натрия, калия, кальция, магния, железа, меди, серебра и др. Изучению концентраций кальция и неорганического фосфата посвящено много исследований10. Однако их результаты неоднозначны. Среднее количество кальция в слюне варьирует от 0,04 - 0,08 г/л (37±7 мкг/мл). Содержание неорганического фосфата - 0,06 - 0,24 г/л (153+16 мкг/мл). В целом, в слюне содержится примерно в 2 раза меньше кальция, чем в сыворотке крови, а неорганического фосфата - примерно в 2 - 10 раза больше. Кальций в слюне находится как в ионизированном (55%), так и в связанном состоянии. Значительная часть кальция связана с белками (в среднем 15%), 30% находится в комплексных связях с фосфатами, цитратом и др. и 5% - в виде ионов. Кальций в слюне может связываться с амилазой, муцином, гликопротеидами.
Методы определения физической нагрузки

О величине нагрузки можно судить по субъективным ощущениям и объективным показателям. К первым относятся ощущения общей и локальной трудности выполнения упражнения, чувство невозможности продолжать работу в установленном темпе и др. Но главную роль в оценке нагрузки играют объективные показатели. Различают два их вида: первый — относящийся к внешней стороне нагрузки, т. е. количественные характеристики выполненной физической работы, оцениваемые по ее внешним параметрам (продолжительность во времени, число повторении упражнений, скорость, темп движений, величина перемещаемого веса и др.); второй — характеризующий ее внутреннюю сторону и отражающий величину и характер физических, биохимических, психологических изменений в организме, обусловленных данной нагрузкой (частота сердечных сокращений, потребление кислорода, величина артериального давления, содержание молочной кислоты в крови и др.). Величина нагрузки прежде всего зависит от ее объема и интенсивности 11

По мнению А. К. Мартусевича, к наиболее значимым из факторов, определяющих функциональный статус являются:

1. Пол человека, а соответственно, и сопряженные и ним особенности

морфологии, функционирования систем организма и регуляторных нейроим-муноэндокринных механизмов.

2. Возрастные характеристики, прежде всего определяемые понятием

«биологический возраст», сущностью которого является степень «постарения» / помолодения» функциональных систем и организма в целом, что оценивается как более информативный критерий по отношению к традиционно используемому «календарному возрасту», не всегда адекватно отражающему обусловленные рассмотренным фактором адаптивно-приспособительные возможности.

3. Наличие или отсутствие физического и эмоционального напряжения, не приводящего к значимому сдвигу параметров, поддерживаемых гомеостатическими механизмами.

4. Особенности анатомо-физиологических показателей органов и систем, не выходящие за пределы нормы и полностью обусловливаемые адаптивными процессами. В качестве одного из наиболее ярких примеров могут служить региональные стандарты, накладывающие существенный отпечаток на форму и характер реагирования организма на различные раздражители как экзогенного, так и эндогенного рода.

В связи со всем вышеперечисленным значимым является мониторинг функционального состояния организма, которые необходимо учитывать при изучении данной методики 12

Результативность занятий физическими упражнениями так же определяются динамикой изменения уровня физической подготовленности и, в частности, физической работоспособности, получения оздоровительного эффекта. Программа по физическому воспитанию высшей школы предполагает использование разнообразных средств с целью поддержания и улучшения состояния здоровья студентов13.

Существующие методы достаточно разнообразны и многие из них не вполне удовлетворяют существующим потребностям. Такие как: Частота сердечных сокращений (ЧСС),субъективные методы, порог анаэробного обмена, гемодинамика, максимальное потребление кислорода14.

Минимальной информацией, которой тренер должен владеть, является оценка факторов риска для сердечно-сосудистой системы и данные о предыдущем опыте занятий и отношении к физическим упражнениям.

Физическое развитие является одним из существенных показателей здоровья. При изучении индивидуального физического развития используются методы наружного осмотра (соматоскопия), измерение морфологических показателей (самотометрия), функциональных показателей (физиометрия). Остановимся подробнее на простейших, но достаточно информативных методах, которые доступны тренеру-инструктору, не требуют длительного обследования и сложной обработки полученных данных.

К методам тестирования физического развития относятся антропометрические измерения, позволяющие получить объективные данные о важных морфологических параметрах тела- длине, массе тела, толщине кожно-жировых складок и т.д.  15

Изучались адаптационные возможности спортсменов различной квалификации при выполнении нагрузок в условиях дозированного физического и эмоционального стресса с использованием метода кардиоинтервалографии и определением кожно-гальванической реакции. Выявлена достоверная зависимость устойчивости адаптационных реакций от уровня спортивной квалификации к этим факторам. Результаты исследований оценивались с помощью метода кардиоинтервалографии (КИГ) по Р.М. Баевскому. Известно, что метод кардиоинтервалографии, предложенный Р.М. Баевским, основан на математическом анализе сердечного ритма, обуславливающим современный информативный и системный подход к исследованию процессов управления сердечным ритмом. Этот метод позволяет определить состояние вегетативного гомеостаза по степени преобладания одного из отделов (симпатического или парасимпатического) вегетативной нервной системы и оценить напряжение регуляторных систем организма в ответ на повышенную физическую нагрузку.16

Аналитические методы исследования в биологии и медицине

В настоящее время в биологии и медицине широко применяются различные аналитические методы для количественного и качественного исследования биологических систем на молекулярном уровне.

Эти же методы применяются в клинической биохимии для анализа различных биологических жидкостей человека, с целью диагностики его физиологического состояния. Классификация этих методов представлена на схеме 1.

Флоуресцентный метод


ВМС США институт стоматологии и биомедицинских исследований (NIDBR) разработала метод оценки концентрации напряжений биомаркеров, таких как кортизол, мелатонин и секреторных IgA в жидкостях организма, включая слюну. Этот метод могут использовать любой из нескольких методов флуоресценции. В настоящее время тест включает в себя два этапа: (1) сканирование образец слюны на фоне химии и (2) добавление флуоресцентных индикаторов и повторных проверок. Компьютерная программа встроена в устройство FP вычитает фоне химии и вычисляет концентрацию напряжений биомаркеров. В будущем, это будет один шаг процесса, включающего одно сканирование и предоставление в режиме реального времени концентрации с отметкой времени. Предел обнаружения данного теста состоит из двух нанограмм на миллилитр кортизола в слюне, который легко получить из слюны.

Моряки, солдаты и летчики занимаются многими видами деятельности, которые создают напряжение и нарушают сон, в результате уменьшения физической и познавательной способности. Это может быть вредно как для эффективности работы так и для выживания. Хотя гражданский стресс и бессонница могут быть связаны с различными видами деятельности, такими как долгая грузоперевозка, расстояния, результаты по производительности то же самое.

Мониторинг бдительности вызывает большой интерес для военных и корпоративных работников, занятых в боевую действиях и критически важных мероприятиях. Современные методы включают психологические и когнитивные стресс-тесты, которые требуют много времени. США 7528952(11).

2 Объекты и методы исследования


Объект исследования

Биологическая жидкость(слюна), гармон Картизол

Методы исследования

Слюна собирается в пенициллиновые флаконы самими испытуемыми за 5 минут до нагрузки и после, в случае со студентами слюна собиралась в перерыве (примерно 3 — 5 минут) между получением нагрузки.

После предварительного промывания полости рта дистиллированной водой испытуемый постепенно ополаскивал рот 5-тью мл воды и собирал слюну до получения общего объема 10-15 мл. Время, отводимое на эту операцию – 5 минут17. Собранная слюна везется в течении 30 минут для центрифугирования и измерения, таким образом слюна после сбора измерялась в течении 4 часов. Центрифугирование производиться (центрифуга Eppendorf Centrifuge 5810 r (Eppendorf, Германия) 20 минут при 3000 оборотах для осаждения остатков пищи зубного налета и других твердых частиц. После чего проводиться измерение на люминометре 20/20n(Tumer BioSystems, США).

Измерение люциферазного индекса (LI)

В работе используют комплект реактивов - аналитической биолюминесценции (NADH:реагент), изготавливаемый в секторе биотехнологии института биофизики СО РАН, 1 флакон препарата содержащий 0.069 единиц активности NADH:FMN-оксидоредуктазы и 0.11 мг люциферазы.

Приготовление раствора NADH:реагента к одному флакону лиофилизо-ванного препарата приливают 500 мкл 0.05М калий (натрий) фосфатного буфера и 500 мкл раствора дитиотрейтола (концентрация 10'2 мг/мл), и выдерживают его 30-40 кинут на льду для восстановления активности ферментов после лиофилнзации.

Измерения контрольного свечения производиться следующим образом: в кювету биолюмииометра вносят реакционную смесь, помещают кювету в прибор и регистрируют интенсивность свечения реакции биолюминесценции после достижения максимума свечения (Ik).

Состав реакционной смеси:



  1. 3-5 мкл препарата ферментов;

  2. 50 мкл 0.002% тетрадеканаля;

  3. 200 мкл 0.05М калий (натрий) фосфатного буфера (рН 6,8-7);

  4. 200 мкл 4-10-4M NADH;

  5. 50mкл 5.10jM FMN.

Активность биферментной системы в определенный момент времени определяется по величине максимальной интенсивности свечения Imax выраженной в относительных единицах или милливольтах. Измерения свечения проводили на кюветном люминометре 20/20n(Tumer BioSystems, США).

Измерения производились следующим образом: в кювету биолюнинометра вносят реакционную смесь, помещают кювету в биолюминометр и регистрируют интенсивность свечения реакции биолюминесценции, после достижения максимума свечения (1К) быстро добавляют 50 мкл нативной слюны, тщательно перемешивают и измеряют интенсивность свечения нового уровня биолюминесценции - I0. Для определения влияния слюны на интенсивность свечения биферментной системы рассчитывали величину люциферазного индекса (LI):

LI=I0/Ik*100%

Где:


Io – максимальная интенсивность свечения,

Ik – максимальная интенсивность свечения при добавлении слюны

Для проведения работы были использованы:


  • Люминометр 20/20n (Turner BioSystems, США)

  • Центрифуга Eppendorf Centrifuge 5810 r (Eppendorf , Германия)

Результаты: получены зависимости интенсивности свечения системы от:



  • Количества нагрузки

  • Концентрации:

    • Воды (для определения эффекта разбавления)

    • Слюны (до и после нагрузки)

    • КРАБа

    • С14

    • NADH

    • FMN

В работе участвовали студенты 3 курса, а также спортсмены спортивного ориентирования в возрасте от 17 – 24.

3 Результаты исследования


Эксперимент 1.

Для определения возможности создания метода биолюминесцентного биотестирования нагруженности организма с использованием слюны в качестве анализируемой жидкости, был проведен эксперемент показывающий влияние слюны на биферментную систему НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при разных количествах нагрузки.

В качестве нагрузки были выбраны приседания, как наиболее простое упражнение, в котором задействовано большая часть мышц. Сбор проб слюны производился после 0, 50, 70, 100, 140 приседаний в пенициллиновые флаконы.

После центрифугирования производился биолюминесцентный анализ биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при добавлении в неё 50 мкл слюны.

При выходе биолюминесцентной системы на максимум (плато) производится добавление слюны 50 мкл, затем производится регистрация интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза.

Рис. 1 Зависимость интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза от количества нагрузки полученой организмом при выполнении упражнения приседания. Наибольшая иетенсивность достигается системой при 50 приседаниях, наиболее сильное тушение происходит при добавлении 50 мкл. слюны после 140 приседаний (максимальная нагрузка)

Из графика видно что наибольшая интенсивность достигается при 50 приседаниях, такой результат может быть обоснован индивидуальными особенностями организма и требует повторения на более широком круге лиц.

Однако показана возможность существования данного биотеста.

Эксперимент 2
Для подбора количества слюны добавляемой в биферментную систему НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза производилось варьирование количеств слюны. В качестве контроля (для исключения эффекта разбавления) производилось такое же варьирование количества воды добавляемой в биферментную систему НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза. Варьирование слюны производилось на образцах без нагрузки и при максимальной нагрузки.

Данный эксперемент производился 2 раза для определения повторяемости результатов.



Рис. 2 Зависимость интесивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при добавлении различных количеств анализируемой жидкости (воды, слюны без нагрузки и слюны при максимальной нагрузки) в количествах 20, 50, 70, 100, 150 мкл.

Состав реакционной смеси:

Фосфатный буфер – 300 мкл (рh 6,9)

КРАБ - 5мкл

С14 - 50 мкл (0,25% спиртовой раствор разводится буфером в 100 раз для получения 0,0025% раствора)

FMN - 10 мкл (5* 10-4)

NADH - 100 мкл (для получения 5 мл с концентрацией 4 * 10-4, навеску в 0.001491г разводится в 5 мл буфера)

Из данного графика видна корреляция большинства точек что показывает повторяемость результатов, также видны наилучшие концентрации слюны.

Эксперимент 3

Целью данного эксперимента был подбор количества компонентов биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, для использования биотестирования с использованием слюны в качестве анализируемой жидкости. Для этого поочерёдно производилось варьирование всех компонентов смеси, слюна добавлялась как и в предыдущих экспериментах после выхода биферментной системы на максимум (плато) в количестве 50 мкл.

Рис. 3 Зависимость ЛИ от количества КРАБ



Рис.4 Зависимость ЛИ от количества НАДН



Рис.5 Зависимость ЛИ от количества C14



Рис.5 Зависимость ЛИ от количества ФМН



Вывод:

В результате проделанного эксперимента были подобраны следующие концентрации реакционной смеси:

Фосфатный буфер – 300 мкл (рh 6,9)

КРАБ - 10мкл

С14 - 10 мкл

FMN - 20 мкл (5* 10-4)



NADH - 100 мкл 4 * 10-

Заключение


В результате анализа возможностей применения биолюминесцентного подхода к контролю тренировочного процесса были сделаны следующие выводы:

    1. Многими источниками литературы обоснованно, что слюна перпективная физиологическая жидкость для проведения анализа состояния организиа.

    2. Проведенные эксперименты по изучению действия слюны человека, в разных физиологических состояниях, на биферментную систему показали, что существует принципиальная возможность создания биотеста на основе влияния слюны на реакцию биолюминесценции.

Данный метод оказался чувствительным к изменению физиологического состояния. Точность анализа 10-12%, время анализа 2-3 минуты.

Планируемые эксперименты:

  1. Оптимизация подбора условий проведения анализа.

  2. Провести анализ биомаркеров (гормон Кортизол), отражающих значимые изменения в организме при физической нагрузке.

  3. Сравнить результаты, полученные биолюминесцентным методом анализа слюны с результатами, полученными иными экспериментальными и классическими методами.

  4. Сформулировать экспресс-метод оценки реакции организма на физическую нагрузку.



Список использованных источников





1Error: Reference source not found СоколоваН.И., Люгайло С.С. спорт высших достижений и акту альныевопросы стоматологической превентологии// Педагогика, 2007 

2Error: Reference source not found Е. И. Львовская, М. В. Тренева. Уровень тревожности и показатели липидной пероксидации у спортсменов, специализирующихся в циклических и ациклических видах// Спортивна медицина, № 1—2, 2009

3Error: Reference source not found Галиулина М. В. Электролитные компоненты смешанной слюны человека в условиях физиологии и патологии полости рта.: Автореф. дне. ... канд. биол. наук. -М., 1988

4Error: Reference source not found Khaustova S.A., Shkurnikov M.U., Tonevitsky A.G. Sports Medicine: Short highly intense exercise causes changes in salivary concentrations of hydrocortisone and secretory IgA//Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2010. Т. 149. № 5. С. 635-639.

5Error: Reference source not found Зайчик В. Е., Багиров Ш. Т. Содержание химических элементов в смешанной нестимулированной слюне здорового человека. -Стоматология, 1991. -с. 14-17.

6Error: Reference source not found Галиулина М. В., Аниснмова И. В., Ганзина И. В. Влияние электролитов на структурные свойства смешанной слюны человека. //Медицинские аспекты изучения организма в норме и патологии. - Омск, 1992, -с.41-43.

7Error: Reference source not found Боровский Е. В., Леонтьев В. К. Биология полости рта. -М.: Медицина, 1991.

8Error: Reference source not found S. S. Mikhailov, E. V. Rozengart, Saliva as the object of biochemical monitoring in sports// Научно-теоретический журнал «Ученые записки», № 6(40) Saint Petersburg state – 2008 год

9Error: Reference source not found Редуто К.В. Барьерная фунуция слюны//Актуальные проблемы современной медицины.-Минск 2007

10Error: Reference source not found Боровский Е. В., Леус П. А., Кузьмина Э. М. Состав и свойства слюны в норне и при кариесе.: Метод, рекомендации. -М., 1980. -с. 3-24.

11Error: Reference source not found Elemental Analysis of Biological Materials. Current problems and Techniques with Special Reference to Trace Elements. -Vienna, 1980.-P.45-49.

12Error: Reference source not found А. К. Мартусевич. Поведение биологических жидкостей и функциональный статус организма человека// Медицинские науки. Теоретическая и экспериментальная медицина. № 2, 2007

13Error: Reference source not found Vengerova N. N. Aerobic abilities of young women organism as an indicator of

Their exersise performance// «Ученые записки», № 5(51) Санкт-Петербург, – 2009 год



14Error: Reference source not found Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. М.Медицина-1981., С.624.

15Error: Reference source not found Michael R. McGuigan, Alison D. Egan and Carl Foster//Salivary cortisol responses and perceived exertion during high intensity and low intensity bouts of resistance exercise// Journal of Sports Science and Medicine (2004) 3, 8-15

16Error: Reference source not found Середенко Л.П., Добровольская Н.А., Начатая Е.С., Власов Г.В.,Калиновская Т.Н. Методы экспрес-диагностики адаптационных возможностей спортсменов в процессе учебно-тренировочной деятельности//Педагогика, психология и медико-биологические проблемы физического воспитания и спорта. –Донецк, 2008

17Error: Reference source not found . Dzhalilov P. B. Change of indicators of serum and saliva of weightlifters under the influence of training load// Научно-теоретический журнал «Ученые записки», № 2 (84) – St.-Petersburg 2012 г



База данных защищена авторским правом ©zubstom.ru 2015
обратиться к администрации

    Главная страница